核黄素类物质对荧光蛋白CFP/Citrine的干扰

论文摘要

生命科学被誉为21世纪的科学,为了揭示生命的奥妙,人们投入了大量的工作。因此,大量的新技术与新方法被用于生命科学领域的研究中。自1948年Fosrter等人提出荧光共振能量转移(FRET)理论后,FRET技术被广泛用于生物大分子结构、免疫分析以及定量分析等方面的研究。而在维多利亚水母中发现的绿色荧光蛋白(GFP)及其变体的成功克隆和分离,为FRET技术提供了适宜的供受体对,大大促进了FRET技术的发展。基于GFP的FRET技术为在活体中发生的生物现象进行实时、原位、无损伤、定量的检测提供了方便。但在活体细胞中存在的一些细胞色素、维生素等具有一定的吸光及发光作用,可能会与荧光供受体对发生内滤光效应或辐射能量转移。如果不考虑这些影响,将会导致对相关FRET计算的误差,以至于对相关的生物过程的错误理解。本实验利用荧光光谱法首次研究了核黄素(RF)和黄素单核苷酸(FMN)对FRET供受体对的影响,为进行活体细胞内研究生物分子提供一定的依据。具体结论如下：1.由于内滤光效应,核黄素的存在会使供体荧光蛋白CFP荧光猝灭；当核黄素加入量比较小时,由于内滤光效应,Citrine的荧光稍微有所猝灭,核黄素加入量比较大时,由于辐射能量转移作用,Citrine的荧光会增大；并且核黄素的存在会严重地影响以CFP/Citrine作为供受体对的FRET强度的测定并出现伪FRET现象。2.由于内滤光效应,FMN的存在会使供体荧光蛋白CFP荧光猝灭；当FMN加入量比较小时,由于内滤光效应,Citrine的荧光稍微有所降低,FMN加入量比较大时,由于辐射能量转移作用,Citrine荧光会增大；并且FMN的存在会严重地影响以CFP/Citrine作为供受体对的FRET强度的测定并出现伪FRET现象。3.由于核黄素类物质的荧光光谱几乎完全重叠,基于FAD不同于其它核黄素类物质的一种性质(即FAD荧光强度会随着放置时间的增长而增大,并在一定时间后达到稳定,且其荧光差值与其浓度呈线性关系),建立了一种核黄素类物质混合物中FAD的定量分析方法,并对多组含标准浓度的FAD溶液进行测定,结果满意。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 绿色荧光蛋白概述
• 1.1.1 荧光蛋白的发现及研究历史
• 1.1.2 GFP的结构及特点
• 1.1.3 GFP的应用
• 1.2 核黄素类化合物概述
• 1.2.1 核黄素的发现及研究历史
• 1.2.2 核黄素的理化性质
• 1.2.3 核黄素的生理功能
• 1.3 荧光共振能量转移研究进展
• 1.3.1 FRET基本原理
• 1.3.2 FRET测定方法
• 1.3.3 FRET的应用
• 1.4 利用MATLAB正交投影法解析混合荧光光谱
• 1.4.1 MATLAB简介
• 1.4.2 交投影法简介
• 1.5 本文研究内容及意义
• 第二章 核黄素对CFP/Citrine的干扰及伪FRET现象
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 实验仪器与试剂
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 核黄素、CFP、Citrine的紫外光谱
• 2.3.2 核黄素、CFP、Citrine的荧光光谱
• 2.3.3 pH值对核黄素荧光的影响
• 2.3.4 核黄素对荧光供体CFP的影响
• 2.3.5 核黄素对荧光受体Citrine的影响
• 2.3.6 核黄素对CFP-Citrine荧光的影响及伪FRET现象
• 2.4 小结
• 第三章 FMN对CFP/Citrine的干扰及伪FRET现象
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 实验仪器与试剂
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 FMN、CFP、Citrine的紫外光谱
• 3.3.2 FMN、CFP、Citrine的荧光光谱
• 3.3.3 pH值对FMN荧光的影响
• 3.3.4 FMN对荧光供体CFP的影响
• 3.3.5 FMN对荧光受体Citrine的影响
• 3.3.6 FMN对CFP-Citrine荧光的影响及伪FRET现象
• 3.4 小结
• 第四章 核黄素类混合物中FAD的测定
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 实验仪器与试剂
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 RF、FMN、FAD的紫外吸收光谱
• 4.3.2 RF、FMN、FAD的荧光光谱
• 4.3.3 RF、FMN、FAD荧光强度随时间的变化
• 4.3.4 工作曲线及样品分析
• 4.3.5 其它条件的影响
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢