绿色木霉LTR-2β-1，3-葡聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

论文摘要

绿色木霉,是一种普遍存在的丝状真菌,在自然界分布广泛,在植物病害生物防治领域占有重要地位。其中的很多菌株都可以产生多种细胞壁裂解酶,主要是β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶。在重复寄生过程中,依靠细胞壁裂解酶攻击植物病原真菌的细胞壁。β-1,3-葡聚糖酶可以催化β-1,3-葡聚糖的水解反应,而很多植物的病原真菌细胞壁的主要成份都含有β-1,3-葡聚糖,因此,β-1,3-葡聚糖酶是抗植物真菌病害的重要物质之一。本文采用PCR的方法以绿色木霉LTR-2的cDNA为模板,扩增得到β-1,3-葡聚糖酶基因（glu）,克隆至载体pMD18-T上,构建了重组质粒pMD18-T-glu。对pMD18-T-glu上插入的β-1,3-葡聚糖酶基因外源片段进行了测序和序列分析。测序结果表明:绿色木霉LTR-2的β-1,3-葡聚糖酶编码基因由2289个核苷酸残基组成,编码762个氨基酸,与报道基本相同。将该序列提交NCBI GenBank,获得编号为EF176582。将β-1,3-葡聚糖酶基因从重组质粒pMD18-T-glu酶切后,连接到毕赤酵母穿梭载体pPIC9K上,构建了重组质粒pPIC9K-glu。采用PEG1000的方法转化毕赤酵母KM71得到重组转化子,PCR扩增证实了β-1,3-葡聚糖酶基因已整合到酵母的基因组中。SDS-PAGE分析和表达产物的酶活性研究证明,β-1,3-葡聚糖酶能有效分泌和高效表达,培养液中酶活达到889U/mL,比原始菌株LTR-2提高了3.76倍,表达产物具有正常的生物学活性,与天然的β-1,3-葡聚糖酶性质基本一致。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1. β-1,3-葡聚糖的分布、结构与功能
• 1.1 β-1,3-葡聚糖的分布
• 1.2 β-1,3-葡聚糖的结构
• 1.3 β-1,3-葡聚糖的生理活性及与结构之间的关系
• 2. β-1,3-葡聚糖酶及其抗病机制
• 2.1 β-1,3-葡聚糖酶的分类及性质
• 2.2 β-1,3-葡聚糖酶的抗病机制
• 3. β-1,3-葡聚糖酶及其基因
• 3.1 微生物β-1,3-葡聚糖酶及其基因
• 3.2 植物β-1,3-葡聚糖酶及其基因
• 3.2.1 基因的研究
• 3.2.2 基因表达的调控和转基因获得抗病植物的研究
• 4. 木霉β-1,3-葡聚糖酶及其基因
• 4.1 生化性质
• 4.2 木霉β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆
• 5. 存在的问题和展望
• 6. 本文主要研究工作及意义
• 7. 实验方案
• 第二章 绿色木霉LTR-2β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 培养基及培养条件
• 2.1.4 菌种保藏技术
• 2.1.5 基因克隆技术
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 绿色木霉LTR-2β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆
• 2.2.2 重组质粒pMD18-T-glu的鉴定
• 2.2.3 重组质粒pMD18-T-glu 所携带的外源片段的核苷酸全序列测定
• 2.2.4 绿色木霉LTR-2 glu 基因及其所编码蛋白的性质分析
• 第三章 绿色木霉LTR-291u 基因在毕赤酵母中的表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株与质粒
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 酶切、去磷酸化（CIAP）、连接反应
• 2法转化大肠杆菌'>3.1.5 CaCl₂法转化大肠杆菌
• 3.1.6 重组质粒的筛选
• 3.1.7 重组质粒转化毕赤酵母
• 3.1.8 目的菌株的筛选
• 3.1.9 重组酵母的PCR 鉴定
• 3.1.10 重组酵母的诱导表达
• 3.1.11 重组酵母β-1,3-葡聚糖酶酶活的茯苓粉平板检测
• 3.1.12 重组酵母β-1,3-葡聚糖酶活性测定
• 3.1.13 重组毕赤酵母表达产物的SDS-PAGE 电泳
• 3.2 实验结果与讨论
• 3.2.1 重组质粒pPIC9K-glu 的筛选、验证
• 3.2.2 质粒pPIC9K 及重组质粒pPIC9K-glu 的物理图谱
• 3.2.3 重组酵母pPIC9K-glu 的筛选
• 3.2.4 重组酵母 pPIC9K-glu 的 PCR 验证
• 3.2.5 重组酵母的酶活检测
• 3.2.6 重组酵母 KGLU14 的电泳验证
• 3.2.7 重组酵母 KGLU14 产酶条件的初步摸索及粗酶液性质的测定
• 总结
• 参考文献
• 致 谢