论文摘要
前言肝缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury IRI）主要发生于休克、肝部分切除及肝移植术中，尤其在肝移植中，已成为制约肝移植疗效的重要因素之一。褪黑素（Melatonin，Mel）因其具有明显的抗氧化及清除自由基作用，使其在IRI方面成为研究热点。本研究以Mel为处理因素，探讨Mel对大鼠肝IRI的保护作用，按时点采集标本，对血清肝组织生化酶系：丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（AKP）；肝组织匀浆抗氧化酶系：超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH.px）及脂质过氧化的终产物丙二醛（MDA）进行测定；对肝组织行HE染色及Caspase-3免疫组化染色，光镜下观察其形态学改变；并在此基础上通过电镜观察肝细胞核和细胞器的变化及凋亡情况，在亚细胞（蛋白表达）水平上探讨褪黑素对肝IRI保护作用及其机制。材料与方法一、实验材料（一）实验分组72只体重在180g—220g，周龄在6—7周的健康雄性Wistar大鼠，随机分为褪黑素处理组（Mel组）、酒精溶媒对照组（Alc组）和生理盐水对照组（NS组）。（二）动物模型制备参照Kobayashi法，用动脉夹夹闭肝门静脉左支、肝动肝左支、左肝管45分钟之后放开，建立大鼠肝左叶、中叶IRI模型，之后每组分别于再灌注后3h、6h、12h、24h采集标本。（三）药品及给药方式Mel组按Mel 20mg/kg体重于缺血前30分钟腹腔注射给药；溶媒对照组采取与Mel组相同浓度的酒精溶液（4％），生理盐水对照组则注射同比例的生理盐水。（四）标本采集及处理1、麻醉给药方式及剂量麻醉采用10％水合氯醛于手术前10分钟大鼠腹腔内注射给药，按0.3ml/100g体重给药。第二次（取标本时）采用相同的麻醉方法。2、相关试剂组织病理及免疫组化染色标本均采用4％甲醛固定；电镜标本则采用2.5％戊二醛固定；SOD、GSH.px、MDA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；血生化相关试剂购自德国宝灵曼公司；Mel 1g及Caspase-3试剂盒购自德国Merck公司3、相关仪器透射电子显微镜/光学显微镜及其照像系统/全自动生化分析仪/石蜡切片机/分光光度计/恒温水浴/电磁搅拌器/离心机/超声乳化机。4、标本的采集第一步：大鼠血清生化酶系第二步：大鼠肝组织氧化酶系第三步：大鼠肝脏形态学、免疫组化及电镜取材二、实验方法（一）血清肝组织生化酶系ALT、AST、AKP的测定（二）肝组织SOD、GSH.px、MDA的测定（三）肝组织的病理学检查（四）Caspase-3免疫组织化学技术—ABC法（五）透射电镜观察肝细胞（六）数据处理及统计学检验免疫组化结果在400倍光镜下观察，计算每个高倍视野100个细胞中Caspase-3染色阳性细胞个数，每张切片计数10个视野，求出均值用（?）±S表示，得出阳性细胞率。所有数据均用统计专业软件SPSS 14.0进行统计，组间比较采用方差分析，各组相互间比较采用SNK检验，P<0.05为差异有显著性。一、大鼠血清肝生化酶系（一）ALT含量ALT在再灌注后各时点的Mel组均显著低于Alc及NS对照组（P<0.05），且Alc组与NS组相比无显著性差异。（二）AST含量AST在再灌注后各时点的Mel组均显著低于Alc及NS对照组（P<0.05），且各时点内Alc组与NS组相比无显著性差异。（三）AKP含量AKP在再灌注后6h、12h、24h时点的Mel组均显著低于Alc及NS对照组（P<0.05），且各时点内Alc组与NS组相比无显著性差异。二、大鼠肝组织抗氧化酶系及丙二醛（一）SOD含量SOD在再灌注后3h、12h、24h时点的Mel组显著高于Alc及NS对照组（P<0.05），在再灌注后6h时点的Mel组显著高于Alc对照组，且各时点内Alc组与NS组相比无显著性差异。（二）GSH.px含量GSH.px在再灌注后各时点的Mel组均显著高于Alc及NS对照组（P<0.05），且各时点内Alc组与NS组相比无显著性差异。（三）MDA含量MDA在再灌注后各时点的Mel组均显著低于Alc及NS对照组（P<0.05），且各时点内Alc组与NS组相比无显著性差异。三、大鼠肝组织Caspase-3免疫组化染色Mel组再灌注后各时点的Caspase-3染色阳性细胞率均显著低于对照组（Alc组和NS组）（P<0.05），且各时点内的Alc组与NS组相比无显著性差异。四、大鼠肝组织HE染色结果发现在再灌注后各时点的Mel处理组的肝细胞变性、坏死的程度与范围，肝索结构的破环程度与范围均明显轻于对照组（Alc组及NS组）。五、大鼠肝组织透射电镜观察结果对照组（Alc组及NS组）在6及12小时时发现了普遍的肝细胞调亡现象，在24小时Alc组及NS组标本中发现了较典型的晚期凋亡现象，相同时点Mel组则很少发现肝细胞凋亡现象。结论外源性Mel可以通过增加肝组织SOD、GSH.px的活性，减少肝组织MDA的生成，抑制肝组织Caspase-3的表达，对肝IRI有明确的保护作用。