论文摘要
目的:survivin和cdc2基因是胶质瘤恶性进展相关基因,但它们在胶质瘤发生发展中的作用尚不清楚。RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术是细胞中双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）介导的特定基因含同源序列mRNA降解从而特异性抑制该基因表达的方法。本实验设计和构建survivin、cdc2基因RNAi的表达小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）逆转录病毒重组载体作为研究两基因功能的工具。研究低分化SHG44-9胶质瘤细胞survivin基因RNAi后生物学性状改变,为今后探索胶质瘤分子病因和基因治疗新方法奠基。方法:利用在线软件siRNA Selection Program和siDirect设计RNA干扰cdc2基因靶序列,siDirect设计RNA干扰survivin基因靶序列,合成回文DNA序列退火后克隆至线性化pSUPER质粒载体,重组质粒载体扩增、抽提后双酶切电泳鉴定和测序分析,再转染phoenix细胞产生逆转录病毒,并利用NIH3T3细胞测定病毒滴度。构建cdc2基因RNAi pSUPER表达siRNA逆转录病毒载体pSUPER.retro-C1和pSUPER.retro-C2。构建survivin敲低pSUPER表达siRNA逆转录病毒载体pSUPER.retro-S1和pSUPER.retro-S2,并转染低分化SHG44-9胶质瘤细胞株,被转染的SHG44-9细胞由RT-PCR、Westernblot测定survivin表达量,流式细胞仪测定细胞周期,MTT法检测细胞增殖生长能力,Tunel法检测细胞凋亡。结果:pSUPER表达siRNA重组质粒载体经双酶切电泳鉴定和DNA测序分析,证实插入的60bp序列与原序列一致,位置正确。测定pSUPER.retro-C1、pSUPER.retro-C2病毒滴度值分别为4.25×105CFU/ml和6×105CFU/ml。测定pSUPER.retro-S1、pSUPER.retro-S2病毒滴度值分别为5.5×105CFU/ml和5.75×105CFU/ml。SHG44-9胶质瘤细胞中pSUPER.retro-S1抑制survivin基因表达效率
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