论文摘要
目的为了研究TLR3在人类胎盘HBV感染中的作用,本课题采用人群研究和体外实验相结合的方法,从基因和蛋白水平初步了解正常孕妇人群与HBsAg阳性孕妇人群胎盘组织TLR3的表达和分布情况以及与HBV宫内感染的关系,根据人群研究提供的线索进一步进行体外实验,探索TLR3在胎盘细胞抵御HBV感染中的作用。①了解TLR3受体在正常孕妇和HBsAg阳性孕妇胎盘组织的基因表达及蛋白分布情况;②了解胎盘组织TLR3 mRNA表达与孕妇HBV感染的关系;从基因水平了解胎盘组织TLR3 mRNA与孕妇外周血HBV DNA含量的关系以及与新生儿HBV宫内感染的关系;从蛋白水平了解TLR3与胎盘HBV感染的关系及与新生儿HBV宫内感染的关系;③研究HBV感染对人胎盘滋养层细胞系Bewo中TLR3 mRNA表达的影响,观察人胎盘滋养层细胞系Bewo中TLR3抗HBV感染的生物学作用。方法①普通半定量RT-PCR和Real time RT-PCR检测正常孕妇和HBsAg阳性孕妇胎盘组织TLR3 mRNA的表达情况,免疫组织化学ABC法检测正常孕妇和HBsAg阳性孕妇胎盘组织TLR3分布情况:②荧光定量PCR检测HBsAg阳性孕妇及其新生儿HBV DNA含量:③建立HBV体外感染人胎盘滋养层细胞模型;高浓度HBV DNA阳性血清与Bewo细胞共培养,荧光定量PCR法检测培养上清中HBV DNA含量:免疫组织化学ABC法检测细胞爬片Bewo细胞中HBsAg:④普通半定量RT-PCR和Real time RT-PCR检测人胎盘滋养层细胞系Bewo中TLR3mRNA的表达;HBV感染前后人胎盘滋养层细胞系Bewo中TLR3 mRNA表达的变化;利用PolyI:C刺激Bewo细胞TLR3 mRNA的表达,设计合成特异的siRNA阻抑Bewo细胞TLR3 mRNA的表达,同时设对照组,Real time RT-PCR检测三组细胞经不同措施干预后TLR3 mRNA的表达变化,同时检测用108copies/ml浓度的HBV DNA阳性血清与上述三组细胞共同培养后上清液中HBV DNA含量的变化。结果①半定量RT-PCR和Real time RT-PCR结果均显示nBsAg阳性孕妇胎盘组织TLR3mRNA含量低于正常孕妇胎盘组织（t=3.003,P＜0.05;t=4.698,P＜0.05）;免疫组化检测41例正常孕妇胎盘TLR3全部阳性,且各层细胞均显示很强的免疫印迹,呈片状分布;所检116例外周血HBsAg阳性孕妇胎盘组织中73.0%TLR3受体阳性,棕黄色信号局灶性分布于被检胎盘的各型细胞中;TLR3在两组的胎盘分布经统计学检验差异有显著性（Fisher’s确切概率P＜0.01）;②胎盘组织TLR3 mRNA水平与孕妇外周血HBV DNA含量无关（F=0.147,P＞0.05）;胎盘组织TLR3 mRNA水平与新生儿宫内感染无关（t=0.888,P＞0.05）;③从蛋白水平研究TLR3与胎盘HBV感染及与新生儿HBV宫内感染的关系,结果显示TLR3阳性不仅是胎盘HBV感染的保护因素（OR=0.259,0.189～0.354）,同时也是新生儿HBV宫内感染的保护因素（OR=0.438,0.204～0.942）之一。④HBV DNA阳性血清与Bewo细胞共培养24小时组、48小时组,在细胞感染后不同时段（24小时、48小时、72小时）的培养上清中均可检出HBV DNA;免疫组织化学ABC法检测细胞爬片Bewo细胞内HBsAg的表达,阳性物质呈细小棕黄色颗粒,多数呈胞浆均质型,少数呈胞浆不均质型,少数细胞核内亦可见阳性表达。光镜下HBsng阳性细胞未见形态学上的明显变化。⑤经普通半定量RT-PCR和Real time RT-PCR检测证实人胎盘滋养层细胞系Bewo中TLR3 mRNA的表达呈阳性;HBV感染Bewo细胞后TLR3 mRNA表达高于对照组（t=4.479,P＜0.05）;PolyI:C刺激Bewo细胞后TLR3 mRNA的表达水平高于siRNA组和对照组（H=13.087,P＜0.05;H=13.100,P＜0.017）,siRNA组和对照组细胞TLR3 mRNA含量无差别（H=3.287,P＞0.05）;用108copies/ml浓度的HBV DNA阳性血清与上述三组细胞共同培养后,三组均可检出HBV DNA,PolyI:C组上清中HBV DNA含量低于siRNA组和对照组,差异有统计学意义（F=8.531,P＜0.05）;siRNA组和对照组差异无统计学意义（LSD检验P＞0.05）。结论①胎盘组织TLR3表达情况与孕妇乙型肝炎病毒感染有关,TLR3高表达是孕妇乙型肝炎病毒感染的保护因素;②蛋白水平的检测结果显示,HBsAg阳性孕妇胎盘组织TLR3阳性率低于正常孕妇胎盘组织,TLR3是孕妇胎盘HBV感染的保护因素,同时也是HBV宫内感染的保护因素;③乙型肝炎病毒可在体外成功感染人胎盘滋养层细胞系Bewo;体外培养的人胎盘滋养层细胞系Bewo可稳定表达TLR3,也可被乙型肝炎病毒直接感染,故此模型可作为研究HBV胎盘感染机制的良好工具:④Bewo细胞受HBV感染后TLR3 mRNA表达上调;PolyI:C刺激可使Bewo细胞TLR3 mRNA表达上调,抗乙型肝炎病毒能力增强。⑤研究结果表明HBV感染与人体初始免疫有关,TLR3在胎盘细胞抵御HBV感染中发挥重要生物学作用,TLR3为胎盘HBV感染及新生几HBV宫内感染的保护因素,人群研究和体外实验结果基本一致,该研究结果将为乙肝防治和HBV宫内感染的预防及治疗提供新思路。