MG-132对心肌缺血再灌注大鼠心脏结构功能及HSP70/CHIP的影响

论文摘要

1.目的和意义：泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin Proteasome System, UPS）是细胞内蛋白质选择性降解的主要途径,参与了细胞内80%以上的蛋白质更新。热休克蛋白70（Heat Shock Protein 70, HSP70）为细胞内源性保护蛋白,是热休克蛋白系统的重要成员,在防止应激引起的细胞损害和修复损伤方面起着重要作用。近期发现,热休克蛋白70羧基端相互作用蛋白（Carboxyl terminus of the Hsc70-interacting protein, CHIP）即是热休克蛋白的辅助分子伴侣又是一个E3泛素连接酶,作为热休克蛋白与泛素-蛋白酶体系统之间的联接蛋白,在应激条件下发挥关键的双分子开关作用。本研究以大鼠心肌缺血再灌注模型作为研究对象,分别观察再灌注前、再灌注2h、24h、7d的CHIP及HSP70的表达及7d的心功能情况,然后通过使用蛋白酶体抑制剂MG-132进行干预,在相应时间点观察上述指标变化,旨在探讨CHIP及HSP70对缺血再灌注心肌的影响。2.研究方法：结扎Sprague-Dawley大鼠左冠状动脉前降支（Left Anterior Descending, LAD）形成心肌缺血,30min后松开LAD达到再灌注,制作心肌缺血／再灌注（I／R）模型,54只大鼠分为以下三大组7个亚组：（1）缺血／再灌注对照（I／R）组：结扎大鼠LAD 30min后再灌注,于再灌注前5min股静脉注入3ml生理盐水,并根据取材时间点的不同,将该组分为I／R2h、I／R 24h、I／R 7d三个亚组,每个亚组8只大鼠。（2）缺血／再灌注+MG-132处理（I／R+T）组：缺血和再灌注时间以及分组情况完全同I／R组,于再灌注前5min股静脉注入0.75mg／kg（溶于3ml生理盐水中）的MG-132,每个亚组8只大鼠。（3）假手术（Sham）组：手术过程同I／R组,但只穿线不结扎LAD,穿线后25min股静脉注入3ml生理盐水,以穿线后开始观察2h；假手术组6只大鼠。连续监测每只大鼠手术前、结扎LAD即刻及再灌注2h的心电图,进行心律失常评分；计算各组存活率；相应时间点检测血流动力学各项指标,酶免法检测血清脑钠肽水平；电镜观察心肌超微结构变化；荧光定量PCR法检测CHIP、HSP70 mRNA表达,免疫组化法及蛋白质印迹法检测CHIP、HSP70的蛋白质水平。3.结果：（1）大鼠生存及死亡分析：8只大鼠于实验中死亡。Sham组大鼠均全部存活；I／R组存活19只,存活率为79%；I／R+T组存活21只,存活率为88%,I／R+T组较I／R组大鼠生存率显著增加（p<0.05）,心律失常是死亡的主要原因。与I／R组相比,IR+T组首次发生心律失常的时间显著延迟（分别为51±22 s vs 129±43 s,p<0.01）,室速、室颤的发生率降低（室速67% vs 40%,室颤19% vs 6%）,持续时间缩短（室速27.1±10.2 s vs 15.8±8.1 s,p<0.05；室颤10.8±5.5 s vs 7.1±2.8 s,p<0.05）,心律失常得分明显下降（分别为3.6±0.7分vs 2.4±0.4分,p<0.05）。（2）HE染色：光镜下,假手术组的心脏三层结构清晰,心肌纤维排列整齐。I／R 24h亚组心肌肌浆红染,梗死周围炎症反应明显,与其相比,I／R+T 24h亚组心肌肌浆红染、炎症反应减轻。I／R 7d亚组见大片心肌组织坏死溶解,被增生的肉芽组织所替代,其间可见散在分布呈岛状或细带状的存活心肌组织,横纹消失,肌丝断裂溶解,核固缩或溶解。I／R+T 7d亚组坏死心肌明显减少。（3）透射电镜：I／R 24h组电镜下可见肌丝排列紊乱、溶解或消失,线粒体肿胀,局部肌丝与闰盘分离,肌纤维明暗带模糊。I／R 7d组心肌细胞线粒体普遍损伤严重,嵴不清楚,细胞核浓缩,多切迹凹陷,染色质分布及排列异常。相应时间点的I／R+T组较I／R组超微结构损伤均有改善。（4）血流动力学变化：与Sham组比较,I／R 7d组大鼠心率增快,左室舒张末压升高,左室收缩压及左室最大收缩速率降低（p<0.05）。I／R 7d组和I／R+T 7d组左室收缩压分别为108±11mmHg和126±10mmHg,左室最大收缩速率分别为4660±480 mmHg/s和5355±554mmHg/s,与I／R组相比,I／R+T组的上述指标均有明显升高（p<0.05）；I／R 7d组和I／R+T 7d组左室舒张末压分别为19±4mmHg和15±3mmHg, I/R+T组有减低趋势。（5）血清脑钠肽（BNP）水平：与I／R 24h组相比,I／R+T 24h组的BNP水平有下降趋势（分别为528±116 pg/ml vs 452±88 pg/ml,p=0.07）; I/R+T 7d组的BNP水平较I／R 7d组下降41%（分别为1486±142 pg/ml vs 883±104 pg/ml,p<0.01）。（6）心肌HSP70及CHIP mRNA水平：心肌HSP70 mRNA水平：与Sham组相比,I／R组和I／R+T组各亚组的HSP70mRNA表达显著升高（p<0.01）；I／R+T 2h组较I／R 2h组升高56%（分别为0.87±0.10 vs 0.50±0.06,p<0.01）；I／R+T 24h组、7d组比I／R相应亚组分别增加45%和48%,p值均小于0.01（I／R 24h组及I／R+T 24h组分别为0.33±0.04 vs0.57±0.07；I／R 7d组及I／R+T 7d组分别为0.19±0.03 vs 0.47±0.06）；I／R组与I／R+T组组内比较,均以2h亚组表达最多。心肌CHIP mRNA水平：I／R 2h组CHIP mRNA相对表达量为0.57±0.07,I／R+T2h组是其2.02倍（1.15±0.12）,两组比较差异有显著性（p<O.01）；I／R 24h组和I／R+T 24h组CHIP mRNA水平分别为0.44±0.06和0.81±0.09,二者相比差异有显著性（p<0.01）；与I／R 7d组相比,I／R+T 7d组升高19%（分别为0.42±0.04 vs0.50±0.07）；I／R与I／R+T各组内比较,均以2h组表达最多。HSP70和CHIP mRNA相关性分析：以各只大鼠心肌组织的HSP70 mRNA表达量为因变量,CHIP mRNA表达量为自变量,采用直线相关分析法进行分析,结果显示：各组大鼠心肌组织中的HSP70 mRNA表达量与心肌组织中的CHIP mRNA表达量呈显著正相关（p<0.01）。所得的直线方程为Y=0.98X-0.12（R2=0.94）。（7）免疫组化检测蛋白质表达：I／R各组的HSP70积分光密度值与Sham组（96±10）相比有显著增加（p<0.01）,其中I／R 2h组最高,为336±26,I／R 24h和7d组分别为266±14和228±13；I／R+T 2h、24h和7d组的HSP70分别为482±37、479±42和393±24,较I／R相应组增高44%、54%和72%,差异均有显著性（p<0.01）。Sham组CHIP积分光密度值为190+12,与其相比,I／R 2h组CHIP水平（278±13）明显升高（p<0.05）,而I／R 24h和7d组较Sham组有所升高,但差异不显著（p>0.05）。MG-132处理增加了CHIP表达,I／R+T 2h、24h和7d组分别较I／R组升高30%、32%、19%（p<0.05）。（8） western-blot检测HSP70及CHIP蛋白质水平：以β-actin作为内对照,HSP70蛋白Sham组为0.21±0.02,I／R各组HSP70表达量均显著高于Sham组,其中I／R 2h组表达量为0.79±0.08,是Sham组的3.76倍；I／R 24h组和I／R 7d组表达量分别是Sham组的2.76倍和2.38倍（p<0.01）。MG-132显著刺激HSP70的表达,I／R+T 2h组、24h组和7d组的HSP70分别为1.28±0.16、0.88±0.12和0.99±0.17,较I／R相应各组升高了62%、52%、98%,差异均有显著性（p<0.01）。Sham组CHIP蛋白为0.68±0.13,I／R 2h、24h组分别为1.04±0.11和0.96±0.13,较Sham组升高53%和41%（p<0.01）,I／R 7d组为0.80±0.10,仍较Sham组高。与I／R组相比,I／R+T 2h组的CHIP水平较I／R 2h组升高38%（p<0.01）,I／R+T 24h组较I／R 24h组增加21%（p<0.05）,I／R+T 7d组与I／R 7d组比较有升高趋势（10%）。HSP70与CHIP蛋白质表达相关性分析：以各只大鼠心肌组织HSP70蛋白水平为因变量,CHIP蛋白为自变量,采用直线相关分析法进行分析,结果显示：各组大鼠心肌组织中的HSP70与CHIP蛋白质水平呈显著正相关（p<0.05）。所得的直线方程为Y=1.22X-0.52（R2=0.89）。4.结论：（1）蛋白酶体抑制剂MG-132能够减少大鼠缺血再灌注早期心肌炎症细胞浸润、改善其超微结构变化,改善心功能,抑制脑钠肽水平,显著减少心肌缺血再灌注后室性心律失常的发生,降低死亡率,具有心肌保护作用。（2）蛋白酶体抑制剂MG-132通过诱导缺血再灌注大鼠心肌组织CHIP表达,上调心肌HSP70水平,从而促进损伤蛋白质的修复。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文正文:MG-132对心肌缺血再灌注大鼠心脏结构、功能及HSP70/CHIP的影响
• 前言
• 第一部分 蛋白酶体抑制剂MG-132对大鼠心肌缺血再灌注早期心脏结构、功能的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 蛋白酶体抑制剂MG-132对心肌缺血再灌注大鼠CHIP、HSP70的影响及其关系
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文