β-酪啡肽-7的制备及其防治酒精性脂肪肝的研究

论文摘要

1β-酪啡肽-7的制备（分离、纯化与鉴定）目的探讨酪蛋白酶解产生β-酪啡肽-7（β-CM-7）的最适条件;建立酶解产物的分离及其鉴定β-CM-7的方法。方法将酪蛋白酶解,其酶解产物经超滤膜过滤,用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法分析其酶解情况。用反相高效液相色谱层析（RP-HPLC）,C18柱,以β-CM-7为标准已知样,利用保留时间外标法和内标法,鉴定酪蛋白酶解产物中的β-CM-7。酶解上清液经Sephadex G-15凝胶层析分离,得到不同组分,然后用RP-HPLC定性和定量鉴定各组分中的β-CM-7。把经过Sephadex G-15凝胶层析分离得到的粗提液进行DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析,得到不同组分,然后用RP-HPLC定性和定量鉴定各组分中的β-CM-7。结果酪蛋白在胃蛋白酶作用下水解120分钟,产生β-CM-7量最多。酶解产物经Sephadex G-15凝胶层析后,酶解产物中小分子物质被分开,经RP-HPLC检测,Sephadex G-15洗脱液的第6组分中含有β-CM-7,其含量为20.5μg·mL-1。DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析进一步提纯Sephadex G-15的第6组分,经RP-HPLC检测,DEAE-Sepharose Fast Flow洗脱液的第3组分中含有β-CM-7,其含量为29.5μg·mL -1。结论酪蛋白经过胃蛋白酶酶解后可以生成β-CM-7。通过Sephadex G-15凝胶层析和通过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析可提纯β-CM-7。通过RP-HPLC的方法可以对β-CM-7加以定性和定量鉴定。2β-酪啡肽-7对小鼠酒精性脂肪肝的防治作用及机制研究目的建立小鼠酒精性脂肪肝（AFL）模型。探讨β-酪啡肽-7（β-CM-7）对AFL的防治作用及其部分作用机制。方法采用胰蛋白酶消化、分离乳鼠肝细胞进行原代培养,乙醇体外诱导肝细胞损伤,以不同浓度的β-CM-7对肝细胞保护,MTT比色法检测肝细胞存活率。通过酒精灌胃的方法建立小鼠酒精性脂肪肝模型。昆明种雄性小鼠60只,随机分为6组:对照组、模型组、护肝片组、β-CM-7Ⅰ组、β-CM-7Ⅱ组和β-CM-7Ⅲ组。除正常组外,其余各组采用酒精溶液灌胃,酒精用量分别为30%、10 mg·kg-1、40%、11 mg·kg-1、50%和12mg·kg-1,四周为一阶段,每日分两次灌胃至第12周末,诱导产生小鼠AFL模型。对照组灌胃等量生理盐水。造模的同时给予药物干预,护肝片组给予护肝片（0.3g·kg-1）。β-CM-7Ⅰ组灌胃β-CM-7（2.0×10-1g·L-1）,β-CM-7Ⅱ组灌胃β-CM-7（2.0×10-2g·L-1）,β-CM-7Ⅲ组灌胃β-CM-7（2.0×10-3g·L-1）,每次250μl。整个实验周期共12周。实验结束时,处死小鼠,收集血清和肝脏。测定体重,肝重,计算肝/体重比值,即为肝脏指数。测定小鼠血清肝功能酶ALT和AST及血脂TG、TC、LDL-C和HDL-C的变化。取小鼠肝组织制备肝匀浆,试剂盒测定肝组织中SOD、GSH-PX活力及MDA含量。取小鼠肝组织作病理切片,HE及油红O染色,行病理学观察。结果β-CM-7对乙醇引起的小鼠原代培养肝细胞的损伤有保护作用。在动物模型实验中,模型组小鼠肝指数显著增高,血清ALT和AST的活性,TG、TC及LDL-C含量均明显增高,HDL-C含量明显降低。组织病理学检查提示,模型组小鼠肝脏出现广泛的细胞内小泡性脂肪变性。β-CM-7能降低小鼠肝脏指数,β-CM-7Ⅰ组肝指数较模型组显著降低（P<0.05）。显示β-CM-7具有保护肝细胞作用。与模型组相比,β-CM-7Ⅰ组ALT和AST含量显著降低,显示β-CM-7有促进小鼠肝细胞脂类代谢作用。与模型组相比,β-CM-7Ⅰ组能显著降低小鼠血清TG和LDL-C含量,提高血清HDL-C含量（P<0.01）。β-CM-7Ⅰ组与模型组相比,小鼠肝组织中SOD和GSH-PX活性显著提高, MDA含量显著降低（P<0.01）,显示β-CM-7具有抑制小鼠肝组织脂质过氧化作用。肝脏组织病理学检查显示,β-CM-7能够减轻肝脏脂肪变性。结论本实验成功地复制了小鼠酒精性脂肪肝模型。β-CM-7对酒精性脂肪肝小鼠有明显的防治作用。β-CM-7对小鼠酒精性脂肪肝防治作用可能与其调节脂质代谢,抗脂质过氧化有关。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 实验系列一：β-酪啡肽-7 的制备（分离、纯化与鉴定）
• 前言
• 材料与方法
• 结果与分析
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 实验系列二：β-酪啡肽-7 对小鼠酒精性脂肪肝的防治作用及机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果与分析
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 对课题的进一步设想
• 简历
• 致谢
• 文献综述
• 参考文献