论文题目: 胡枝子干旱胁迫下渗透物质变化以及外源基因Sac B对美丽胡枝子的遗传转化研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 林木遗传育种
作者: 杜金友
导师: 陈晓阳
关键词: 胡枝子,胁迫生理,再生体系,基因,农杆菌转化,抗逆性
文献来源: 北京林业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 胡枝子属（Lespedeza Michx.）,是优良的水土保持和饲料型豆科灌木。有关胡枝子干旱生理、遗传改良等方面研究还处于空白阶段。本研究通过干旱胁迫实验,测定了胡枝子6个种的渗透调节物质的变化,在此基础上,选择美丽胡枝子（L.formosa（Vog.）Koehne）为材料,研究了再生系统和遗传转化体系,将抗逆基因Sac B导入美丽胡枝子中,并通过分子检测以及功能验证,获得了转基因植株。 干旱胁迫可以导致胡枝子体内可溶性蛋白含量的持续下降,热稳定蛋白含量在一个短暂的升高后,迅速下降。可溶性糖含量随着土壤相对含水量的下降逐步升高。从本试验结果来看,可溶性糖在胡枝子渗透胁迫的调节方面可能起到了重要作用。 以美丽胡枝子为材料,研究6-BA、2.4-D以及NAA等激素条件下不定芽的分化、增殖和生根情况。实验结果表明,6-BA 0.5mg/L+2.4-D1mg/L+NAA 0.5mg/L获得的有效不定芽最多,美丽胡枝子子叶节分化不定芽受6-BA影响较显著,其比较适宜的浓度应在0.5～1mg/L之间。获得高质量的增殖不定芽的适宜6-BA浓度应在0.1～0.2 mg/L之间。NAA浓度对不定芽生根有极显著影响,生根的最适NAA浓度在0.1～0.5mg/L之间。由此,建立了美丽胡枝子的再生系统。 美丽胡枝子对抗生素耐性较强。当卡那霉素的浓度大于350mg/L,才可以抑制子叶节不定芽的分化。但是高浓度的卡那霉素（Kan）对美丽胡枝子不定芽生根具有较强烈的抑制作用,羧苄青霉素（Carb）对子叶节不定芽分化及茎段增殖的抑制作用更弱。据此确定了抗生素筛选培养浓度:不定芽分化培养为Kan350 mg/L+Carb500mg/L;继代培养为Kan300mg/L+Carb500mg/L;从第二次继代后,羧苄青霉素的浓度可以降到300mg/L;生根培养为150mg/L+Carb300mg/L。通过实验,确立了美丽胡枝子的遗传转化体系:（1）以生长健壮的美丽胡枝子无菌苗子叶节为材料,预培养2d;（2）将子叶节在OD600值为0.5左右的农杆菌菌液中浸染30-35min;（3）吸干菌液后,在含100uM乙酰丁香酮的MS0培养基中,黑暗共培养2天;（4）转至含有350mg/L Kan和500mg/L Carb的分化培养基中进行筛选。 据PCR检测结果,转基因植株与载体上原基因的PCR结果在大小上是一致的;PCR-Southem检测结果显示,转基因美丽胡枝子扩增出的片段与探针能够杂交,插入美丽胡枝子基因组中的外源片段在核苷酸序列方面也与原基因一致;从RT-PCR检测结果看出,插入的cpy-Sac B基因已经正常表达。所有这些实验验证了目的基因已经整合到了美丽胡枝子的基因组中。 通过模拟胁迫验证了转Sac B基因美丽胡枝子的功能。转基因植株的可溶性糖含量比未转化苗有较大幅度提高,可以在NaCl 200mmol/L以及PEG 5%中生长,而未转化苗停止生长并黄化及有部分植株落叶。说明转化材料携带的Sac B基因能够表
论文目录:
摘要
ABSTRACT
缩写词
1 文献综述
1.1 胡枝子研究概况
1.2 植物抗旱基因工程
1.2.1 与植物抗旱相关的物质
1.2.1.1 渗透调节物质，可溶性糖
1.2.1.2 离子和水分通道蛋白
1.2.1.3 Lea蛋白
1.2.2 与植物抗旱性相关的调控元件和因子
1.2.3 干旱胁迫信号的传导
1.2.4 植物抗旱的基因工程应用
1.3 果聚糖的生理作用及其合成关键酶基因工程
1.3.1 果糖糖代谢的生理作用
1.3.2 果聚糖与抗逆性
1.3.3 Sac B基因工程
1.4 豆科植物再生系统研究
1.4.1 直接分化再生系统
1.4.2 愈伤组织再生系统
1.4.3 胚状体再生系统
1.4.4 原生质体再生系统
1.4.5 离体再生的影响因素
1.5 本研究的目的和意义
1.6 本研究的总体思路
2 干旱胁迫条件下胡枝子渗透物质变化
2.1 材料与方法
2.1.1 实验材料
2.1.2 干旱胁迫处理
2.1.3 脯氨酸含量的测定
2.1.3.1 取样
2.1.3.2 测定
2.1.4 可溶性糖含量的测定
2.1.4.1 取样
2.1.4.2 测定
2.1.5可溶性蛋白及热稳定蛋白提取及含量测定
2.1.6 统计的数据与处理
2.2 结果与分析
2.2.1 干旱胁迫下胡枝子脯氨酸含量变化
2.2.2 干旱胁迫下胡枝子可溶性糖含量变化
2.2.3 干旱胁迫下胡枝子可溶性蛋白含量变化
2.2.4 干旱胁迫下胡枝子热稳定蛋白含量变化
2.3 讨论
3 胡枝子再生系统的建立
3.1 材料与方法
3.1.1 供试材料及试剂
3.1.2 处理方法
3.1.2.1 MS_0基本培养基
3.1.2.2 无菌苗的培养
3.1.2.3 不定芽分化
3.1.2.4 茎段增殖
3.1.2.5 生根
3.1.2.6 培养条件
3.1.3 培养基配方设计
3.1.3.1 美丽胡枝子子叶节分化培养基的筛选
3.1.3.2 美丽胡枝子不定芽增殖培养基的筛选
3.1.3.3 美丽胡枝子不定芽生根培养基的筛选
3.1.3.4 数据的分析
3.2 结果与分析
3.2.1 6-BA，NAA，2,4-D对美丽胡枝子子叶节分化的影响
3.2.2 6-BA，NAA对美丽胡枝子不定芽增殖的影响
3.2.3 6-BA，NAA对美丽胡枝子不定芽生根的影响
3.3 讨论
4 胡枝子抗生素敏感性试验
4.1 材料与方法
4.1.1 材料与试剂
4.1.1.1 供试材料
4.1.1.2 主要化学试剂
4.1.1.3 植物组织培养基
4.1.1.4 卡那霉素对美丽胡枝子不定芽再生及试管苗生根的影响的处理方法
4.1.1.5 羧苄青霉素(Carb)对美丽胡枝子子叶节不定芽分化的影响
4.1.1.6 调查项目
4.2 结果与分析
4.2.1 卡那霉素和羧苄青霉素对美丽胡枝子子叶节不定芽分化的影响
4.2.2 卡那霉素和羧苄青霉素对美丽胡枝子子叶节增殖的影响
4.2.3 卡那霉素和羧苄青霉素对美丽胡枝子子叶节不定芽生根的影响
4.3 讨论
5 Sac B基因对胡枝子的遗传转化
5.1 材料与方法
5.1.1 试验材料
5.1.2 菌种与质粒
5.1.3 主要化学试剂
5.1.4 培养基成分
5.1.4.1 农杆菌培养基(YEP培养基)
5.1.4.2 植物组织培养基
5.1.5 农杆菌的培养与转化步骤
5.1.5.1 菌种活化
5.1.5.2 转化程序
5.1.6 影响农杆菌转化效果的实验设计
5.1.6.1 乙酰丁香酮(AS)
5.1.6.2 菌液浓度
5.1.6.3 共培养时间
5.2 结果与分析
5.2.1 乙酰丁香酮(AS)对美丽胡枝子子叶节转化的影响
5.2.2 菌液浓度对美丽胡枝子转化的影响
5.2.3 共培养时间对美丽胡枝子转化的影响
5.3 讨论
6 转基因植株的分子检测
6.1 材料与方法
6.1.1 实验材料
6.1.2 实验试剂
6.1.3 转化材料的PCR鉴定
6.1.3.1 DNA 的提取
6.1.3.2 聚合酶链式反应(PCR)检测
6.1.4 转化材料的RT-PCR鉴定
6.1.4.1 RNA的提取
6.1.4.2 RT-PCR(参考TaKaRa AMV kit3.0)
6.1.4.3 RT-PCR反应体系：
6.1.4.4 RT-PCR反应程序
6.1.5 PCR-Southem 分子杂交
6.1.5.1 DIG-DNA 探针的制备
6.1.5.2 DIG-DNA Labeling 反应
6.1.5.3 转模及DNA的固定
6.1.5.4 杂交步骤
6.1.5.5 洗模
6.1.5.6 显色反应
6.2 结果与分析
6.2.1 转基因美丽胡枝子的PCR鉴定
6.2.2 转基因美丽胡枝子的PCR-Southem鉴定
6.2.3 转基因美丽胡枝子的RT-PCR鉴定
6.3 讨论
7 转Sac B基因美丽胡枝子的功能验证
7.1 材料与方法
7.1.1 实验材料
7.1.2 实验设计
7.1.2.1 美丽胡枝子组培苗对Nacl、PEG的耐性试验
7.1.2.2 NaCl胁迫下转基因美丽胡枝子生长状况及可溶性糖含量检测
7.1.2.3 PEG胁迫下转基因美丽胡枝子生长状况及可溶性糖含量检测
7.1.2.4 可溶性糖含量检测方法
7.2 结果分析
7.2.1 美丽胡枝子组培苗对Nacl、PEG的耐性试验
7.2.2 NaCl胁迫下转基因美丽胡枝子生长状况及可溶性糖含量检测
7.2.3 PEG胁迫下转基因美丽胡枝子生长状况及可溶性糖含量检测
7.3 讨论
8 结论
参考文献
附图
个人简介
导师简介
获得成果目录清单
致谢
发布时间: 2005-07-12
参考文献
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