枸杞类胡萝卜素合成酶基因（PSY、LycB）的克隆及其转化洋桔梗的研究

论文摘要

类胡萝卜素具有许多重要的生物学功能。在植物中，类胡萝卜素是光合作用的辅助色素，为光合作用捕获光能；另一方面，它们在高温强光下能通过叶黄素循环耗散过剩的能量，保护叶绿素免受高温强光的破坏；同时也赋予了植物花朵果实鲜艳的色彩，具有重要的农艺价值。在保护人类健康方面，类胡萝卜素起着更重要的作用，约有10％的类胡萝卜素是维生素A的前体。因此利用基因工程手段调控植物体内类胡萝卜素的代谢和积累，改良果蔬品质、改变花色，倍受到人们关注。 枸杞是我国传统中药，富含类胡萝卜素。目前还未见有关枸杞类胡萝卜素合成关键酶基因克隆方面的报道。因此本论文以枸杞为试验材料，进行枸杞类胡萝卜素合成关键酶基因（PSY、LycB）的分离，为应用基因工程技术改变植物体内类胡萝卜素成份和提高类胡萝卜素含量提供基因资源。 洋桔梗是目前国际上十分流行的盆花和鲜切花之一，具有较高的经济价值和观赏价值。通过转基因技术来改变花色，是一种较常规技术更为有效、快速的方法，是现代生物技术在花卉育种中的具体应用。 本研究构建了枸杞叶片cDNA文库，利用同源序列法从枸杞叶片cDNA文库中克隆了八氢番茄红素合成酶基因（PSY）和番茄红素β-环化酶基因（LycB），构建了植物表达载体，并建立了洋桔梗叶片体外再生体系，利用农杆菌介导法将PSY基因导入洋桔梗，获得以下结果。 1、利用λExCell载体构建了枸杞叶片cDNA文库，文库滴度为2.78x105pfu／ml，重组效率为88.1％。 2、参照其它植物的PSY、LycB基因序列设计引物，采用PCR技术从枸杞叶片cDNA文库中分离到PSY、LycB基因，并将其克隆到T载体。序列分析表明，PSY基因cDNA全长1292bp，阅读框位于7～1284bp之间，共编码425个氨基酸。PSY cDNA核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其他植物的同源性分别为75％～80％和70％～80％。在Genbank中登记号为AY920918；LycB基因cDNA全长1541bp，编码508个氨基酸，核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其他植物的同源性分别达78％和70％以上，进化系统上存在高度的保守性。在Genbank中登记号为AY906864。并对PSY、LycB基因所编码的蛋白质的基本特性、氨基酸组成以及二级结构进行了分析。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1 类胡萝卜素生物合成相关基因克隆及其基因工程研究进展
• 1.1 类胡萝卜素的生物学功能
• 1.2 类胡萝卜素的生物合成途径
• 1.3 类胡萝卜素生物合成的主要酶及其基因
• 1.4 类胡萝卜素基因工程
• 1.5 问题及展望
• 2 洋桔梗组织培养和基因工程研究进展
• 2.1 洋桔梗组织培养研究进展
• 2.2 洋桔梗基因工程研究进展
• 3 cDNA文库构建研究进展
• 3.1 经典cDNA文库的构建
• 3.2 新型cDNA文库的构建
• 3.3 cDNA文库技术的局限性
• 4 立题依据及技术路线
• 4.1 立题依据
• 4.2 技术路线
• 第二章 枸杞叶片cDNA文库的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA的提取与mRNA的分离
• 2.2 双链cDNA的合成
• 2.3 文库滴度及重组效率的测定
• 2.4 cDNA插入片段的分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 枸杞类胡萝卜素合成酶基因PSY、LycB的克隆与序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 PSY基因的扩增与克隆
• 2.2 PSY基因序列分析
• 2.3 PSY基因所编码的蛋白质特性分析
• 2.4 LycB基因的扩增与克隆
• 2.5 LycB基因序列分析
• 2.6 LycB基因所编码的蛋白质特性分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 PSY基因和LycB基因植物表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 PSY基因的PCR扩增
• 2.2 PSY基因的T-vector克隆
• 2.3 PSY基因植物表达载体的构建与鉴定
• 2.4 LycB基因的PCR扩增
• 2.5 LycB基因的T-vector克隆
• 2.6 LycB基因植物表达载体的构建与鉴定
• 2.7 农杆菌的检测
• 3 讨论
• 4 小结
• 第五章 洋桔梗叶片体外再生体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 技术路线
• 1.3 试验方案及方法
• 1.4 试验结果观察与数据统计
• 2 结果与分析
• 2.1 6-BA和NAA对不定芽分化的影响
• 3对不定芽株高生长的影响'>2.2 赤霉素GA₃对不定芽株高生长的影响
• 2.3 生长素对不定芽生根的影响
• 2.4 再生苗的移栽
• 3 讨论
• 4 小结
• 第六章 利用农杆菌介导法将PSY基因导入洋桔梗的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 质粒和菌株
• 1.3 洋桔梗叶片不定芽诱导及农杆菌转化所用培养基
• 1.4 头孢霉素（Cef）浓度的确定
• 1.5 卡那霉素（Km）适宜筛选浓度的确定
• 1.6 影响农杆菌转化因素的试验
• 1.7 洋桔梗遗传转化方法及步骤
• 1.8 抗性植株的分子检测
• 2 结果与分析
• 2.1 头孢霉素（Cef）浓度的确定
• 2.2 筛选压的确定
• 2.3 农杆菌侵染效果
• 2.4 菌液浓度对叶片分化的影响
• 2.5 侵染时间对叶片分化的影响
• 2.6 共培养时间对叶片分化的影响
• 2.7 AS浓度对叶片分化的影响
• 2.8 农杆菌介导洋桔梗叶片转化再生流程
• 2.9 抗性植株的分子检测
• 3 讨论
• 4 小结
• 结论
• 本试验的主要创新点
• 需要进一步研究的工作
• 参考文献
• 致谢
• 附图
• 博士在读期间论文发表情况