论文摘要
多溴联苯醚（Polybrominated diphenyl ethers, PBDEs）是一类新发现的潜在的持久性有机污染物（Persistent Organic Pollutants, POPs）,作为阻燃剂被广泛用于电子产品、纺织品、建筑材料以及塑料制品等中。它具有高脂溶性、化学稳定性、低降解性以及低挥发性等特性,可通过物理性渗漏和化学性结合作用使其在环境中蓄积。环境流行病学调查结果发现,PBDEs广泛存在于环境介质（如空气、水、土壤以及底泥）,动物体内（鱼体、巨鲸及鸟类）和人体（乳液、血液及脂肪组织）等中,对环境及人体健康构成潜在的危害。体内外实验结果表明,PBDEs具有肝脏毒性、免疫毒性、神经毒性、生殖毒性、内分泌干扰以及致癌等多种毒作用。动物实验发现,暴露PBDEs可引起成年期脑功能异常,主要表现为自发行为紊乱和学习记忆功能缺陷等神经系统症状。何卫红等研究表明,四溴联苯醚（2,2’, 4,4’-tetrabromodiphenyl ether,PBDE-47）可致人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞氧化应激、微核形成和DNA损伤等毒性效应。Reistad等学者进行体外实验发现,五溴联苯醚（2,2’,4,4,6’-tetrabromodiphenyl ether）和PBDE-47可诱导人粒性白细胞活性氧水平的增加,并且呈剂量依赖关系。Kodavanti等研究表明,PBDEs可导致蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）易位和钙稳态失衡,而这可能是活性氧（reactive oxygen species, ROS）形成的机制。PBDE-47是生物样本和人体材料中含量最高的PBDEs同系物之一。因此,检测PBDE-47诱导产生的活性氧以及由其所诱导的DNA损伤之间的关系就是本文的研究目的之一。多氯联苯（Polychlorinated, PCBs）是一种研究较深入的典型持久性有机污染物,国际癌症研究机构将其列为“人类可能的致癌物质”和“动物已知的致癌物质”。虽然环境中的PCBs有下降的趋势,但还是处于一个相对较高的水平,故仍然是一种重要的不容忽视的持久性有机污染物。有研究表明PCBs亦可致细胞氧化应激和微核形成等DNA损伤效应。更值得注意的是,流行病学调查资料证实,PBDEs和PCBs在多种环境介质中共存,在人体乳液、血液以及脂肪组织中也检出了两者的同时存在,并且二者具有相似的毒性终点。因此我们考虑当这两种物质同时存在时对DNA损伤是否具有存在联合作用?为了回答这一问题,我们分别选取PBDEs和PCBs在生物样本及人体材料中含量最高的同系物之一的PBDE-47和2,2’, 4,4’,5,’-hexachlorobiphenyl（PCB153）作为受试物,首次选用ROS、DNA链断裂和8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxydeoxyguanosine, 8-OHdG）等指标对二者的联合作用进行了研究。DNA修复系统在维持DNA分子结构完整性和稳定性、保持细胞的存活和正常的生理活动等方面都具有重要的意义。如果DNA修复系统功能缺陷或丧失,则势必会造成受损的DNA不能被有效修复从而诱发突变,使基因组的不稳定性增加,最终导致细胞的恶性转化。DNA修复酶会根据DNA损伤的程度和类型发生相应的变化,故可根据DNA修复酶的变化来间接的判断DNA损伤情况。XRCC1（X线修复交叉互补组1）是影响细胞对电离辐射敏感性的第一个哺乳类动物基因,在DNA单链损伤修复中起主要作用。它主要通过与多聚ADP核糖聚合酶（PARP）、DNA连接酶III和DNA聚合酶β相互作用,来修复包括氧化应激在内的多种损害引起的DNA损伤。XRCC3（X线修复交叉互补组3）主要是通过核苷酸切除修复途径对DNA双链断裂进行同源重组修复。基于上述理由,本实验选用主要针对DNA单链断裂修复的XRCC1基因和主要针对DNA双链断裂修复的XRCC3基因,通过对其mRNA水平的测定,进一步阐明PBDE-47和/或PCB153对DNA损伤的影响,为研究PBDE-47的毒作用机制以及和PCB153的联合作用方式提供理论依据。本论文由两部分组成:第一部分PBDE-47与PCB153单独和联合染毒对SH-SY5Y细胞氧化应激和DNA损伤作用的影响目的探讨PBDE-47与PCB153单独和联合染毒对SH-SY5Y细胞氧化应激和DNA损伤的影响。方法体外培养的SH-SY5Y细胞暴露于1、5、10μM PBDE-47（低、中、高剂量组）单独染毒组和与5μM PCB153联合染毒组以及100μM抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）组,以DMSO为溶剂对照,染毒24 h后分别采用荧光染料DCFH-DA标记法,单细胞凝胶电泳试验和高效液相色谱-电化学技术（HPLC-ECD）分别检测细胞内活性氧（ROS）水平、DNA链断裂和8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）的含量。结果中、高联合染毒组ROS水平与对照组相比显著增加（P<0.05）,并显著高于相应的单独剂量染毒组（P<0.05）,加入抗氧化剂后细胞内ROS水平明显下降（P<0.05）,细胞内ROS水平与PBDE-47染毒剂量呈现剂量-效应关系;中、高剂量PBDE-47单独染毒组和联合染毒组细胞尾部DNA百分率、Olive尾距均显著高于对照组（P<0.05）,且呈现明显的剂量-效应关系;中、高联合染毒组细胞尾部DNA百分率显著高于相应的PBDE-47或PCB153单独染毒组,中剂量PBDE-47与PCB153联合染毒组Olive尾距显著高于相应的PBDE-47或PCB153单独染毒组（P<0.05）,加入抗氧化剂后其细胞尾部DNA百分率及Olive尾距均显著下降（P<0.05）;高剂量PBDE-47单独染毒组和中、高剂量联合染毒组8-OHdG的含量与对照组相比均有明显的增加（P<0.05）,中、高剂量联合染毒组8-OHdG含量均明显高于相应的单独染毒组（P<0.05）,加入抗氧化剂后其细胞内8-OHdG含量明显下降（P<0.05）。相关分析结果表明,细胞内ROS水平与8-OHdG含量、尾部DNA百分率及Olive尾距呈正相关关系（相关系数分别为0.895、0.886、0.836,P<0.05）。结论一定剂量的PBDE-47可致DNA损伤,PCB153可增强PBDE-47对SH-SY5Y细胞DNA的损伤作用,氧化应激可能在PBDE-47致DNA损伤方面发挥了重要作用。第二部分PBDE-47与PCB153单独和联合染毒对SH-SY5Y细胞DNA修复酶表达的影响目的研究PBDE-47与PCB153单独和联合染毒对SH-SY5Y细胞DNA修复酶XRCC1 mRNA和XRCC3 mRNA表达的影响。方法按第一部分的剂量分组和染毒方法对SH-SY5Y细胞染毒24 h后,用荧光定量PCR测定细胞内DNA修复酶XRCC1和XRCC3 mRNA的表达情况。结果高剂量PBDE-47单独染毒组及中、高剂量联合染毒组XRCC1 mRNA表达与对照组相比均明显下降（P<0.05）;高剂量单独染毒组与低剂量单独染毒组相比,XRCC1 mRNA的表达明显下降（P<0.05）;加入抗氧化剂后其XRCC1 mRNA表达明显上升（P<0.05）。高剂量PBDE-47单独染毒组和高剂量联合染毒组XRCC3 mRNA表达与对照组相比均明显上升（P<0.05）,加入抗氧化剂后XRCC3 mRNA的表达明显下降（P<0.05）。相关分析结果表明,细胞内ROS水平与XRCC1 mRNA的表达呈负相关（相关系数为0.83,P<0.05）,与XRCC3 mRNA的表达无明显相关（相关系数为0.42,P>0.05）。细胞DNA Olive尾距与XRCC1 mRNA的表达呈负相关,而与XRCC3 mRNA的表达呈正相关（相关系数分别为0.73,0.77, P<0.05）。结论一定剂量的PBDE-47可影响DNA修复酶的表达,ROS对XRCC1修复酶具有抑制作用,而被抑制的XRCC1修复酶可能是PBDE-47致DNA损伤的一个可能原因。