论文摘要
肺炎链球菌是引起肺炎、脑膜炎、中耳炎的主要致病菌,是引起世界范围婴幼儿、老年人、免疫缺陷个体感染的主要原因之一。由于新型抗生素研发的相对滞后及临床上常出现抗生素运用的不当,该菌耐药性菌株日益增多,因此疫苗对防治感染的作用越来越重要。目前针对肺炎链球菌的疫苗应用较多的是第一代23价肺炎多糖疫苗和第二代7价肺炎多糖一蛋白偶联疫苗,前者主要问题在于单纯多糖是T细胞非依赖性抗原,对免疫系统发育不完善的2岁以下婴幼儿以及老年人的保护性弱;而多糖蛋白偶联疫苗的荚膜多糖只有7种血清型,数量有限,对肺炎高发人群保护作用小,且生产成本高、不适合在发展中国家大量使用,并有可能引起临床上流行肺炎球菌血清型的改变。新型核酸疫苗技术近年来引起了防治肺炎球菌疾病研究的重视,对于肺炎球菌核酸疫苗的研究在动物中已得到开展,以诱导抵制不同蛋白抗原免疫应答为目的的核酸疫苗已在疾病模型中显示了它们的保护效果。然而,核酸疫苗目前要解决的主要问题是其诱导的特异性免疫应答水平不足以满足预防和治疗性疫苗的要求,表现为核酸疫苗对小动物较免疫效果好,但对人类或灵长类动物无效或者诱导的免疫应答太低缺乏免疫保护或治疗作用。肺炎球菌溶血素（Pneumolysin,PN）是肺炎球菌产生的最主要毒素之一,是肺炎球菌产生的唯一能破坏宿主防御、补体和免疫应答的毒力蛋白,所有不同血清型肺炎链球菌的PN分子构造或抗原性相似,相互之间有交叉免疫保护作用,因而成为肺炎球菌核酸疫苗的理想候选基因之一。其邻近羧基端的11个氨基酸序列为细胞毒性所必需,为保证疫苗的安全性,本研究在构建核酸疫苗时切去肺炎球菌溶血素基因羧基端33个核苷酸以去除其溶血活性,并采用体内电转染初免结合蛋白质加强的免疫策略以增强核酸疫苗在小鼠和非人灵长类动物体内的免疫原性。根据Walker等1987年报道的肺炎球菌溶血素基因序列（GenBank accessionno.X52474）,设计引物,运用PCR技术从肺炎球菌基因组DNA中扩增出肺炎球菌溶血素全长基因（pn）和切去羧基端33个核苷酸的基因（pnd）。对PCR产物进行酶切、回收,将pn插入到pET-28a中构建成pET-pn重组体,将pnd插入到pET-21a载体中,构建成ET-pnd重组体,经鉴定后将pET-pn转化进宿主菌JM109（DE3）感受态细胞中,将pET-pnd转化进BL21（DE3）感受态细胞中,IPTG诱导表达,通过超声波破菌,用固相Ni-NTA树脂作亲和吸附纯化。经SDS-PAGE、溶血活性测定和Western-blotting检测证实,蛋白表达的产物相对分子量为52KDa和50KDa,纯化后的蛋白纯度达到90%以上。PND蛋白完全丧失溶血活性,但抗原性不受影响,完好保留了原PN蛋白质的抗原表位,可用作检测试验和核酸疫苗加强免疫的蛋白质抗原。再将pn和pnd基因插入到pVAX1载体中,构建Pn和Pnd重组质粒。将重组表达质粒转化进大肠杆菌DH5α宿主细胞,经琼脂糖凝胶电泳和DNA测序分析鉴定正确后大量抽提质粒DNA,并去除内毒素,配制Pn和Pnd核酸疫苗。将构建好的核酸疫苗对小鼠和恒河猴进行DNA免疫。8周龄雌性Balb/c小鼠随机分组,每组5只。对照组注射pVAX1空质粒,实验组小鼠每只两侧胫骨前肌内注射10μg肺炎球菌Pn或Pnd核酸疫苗,注射后立即于注射部位用活体基因导入仪进行体内电转染。每隔两周免疫1次,共3次,为初免。第3次核酸疫苗免疫后2周,用各核酸疫苗相应的纯化PN或PND蛋白质抗原进行加强免疫,每只小鼠腹腔注射50μg不加佐剂的抗原蛋白。在第3次DNA免疫和蛋白质抗原加强免疫后的第10天采血,分离血清作免疫印染或ELISA间接法检测血清特异性抗体及其效价。结果显示小鼠肌肉内注射10微克核酸疫苗加电转染能诱导出特异性抗体免疫应答。采用相应蛋白加强,小鼠血清特异性抗体的几何平均滴度比加强前提高约4倍。4-6岁（4-5公斤）恒河猴随机分为2组,每组2只,采用TwinInjector注射装置,分别肌肉注射Pn和Pnd核酸疫苗0.5mg/只,每4周免疫1次,共3次,末次免疫14天后用相应的PN或PND蛋白腹腔接种进行加强免疫（500μg/只）,在第3次免疫或蛋白加强后第10天分别采血,用ELISA间接法测其效价。结果显示给恒河猴肌肉内注射0.5mg核酸疫苗加电转染能诱导出特异性抗体免疫应答,采用相应蛋白加强,恒河猴血清特异性抗体的几何平均滴度比加强前提高了约4倍。因此,采用电转染技术结合DNA初免-加强免疫的策略,能显著增强肺炎球菌溶血素核酸疫苗在小鼠和恒河猴体内的特异性免疫应答。通过本课题,在国内首次制备成功适合发展中国家的第三代肺炎链球菌溶血素核酸疫苗,并首次在国际上采用灵长类动物模型来验证肺炎球菌溶血素核酸疫苗的免疫原性和免疫保护效果,旨在为增强此疫苗在大动物体内的免疫效果提供新方法,为研制开发用于临床的肺炎球菌核酸疫苗奠定了基础。
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