蛋白质组学解析正常肝细胞与肝癌细胞DNA损伤修复相关复合物的研究

论文摘要

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,是我国位居第二的癌症“杀手”。目前,对于肝癌的发病机制一直不太清楚。DNA损伤修复失败被认为是发生癌症的一个重要原因。其中,DNA双链断裂（DSB）是一种最严重的DNA损伤,可以在如细胞减数分裂的同源染色体重组、V（D）J重组及某些DNA损伤修复等生理过程中作为中间产物产生;也可以在外源性电离辐射和DNA断裂剂如抗癌药物、遗传毒物等损害过程中产生。如果DSBs产生的伤害不能修复,将可能直接导致肿瘤的发生。目前,DBS重组修复相关的蛋白复合物的研究及其对细胞和生物体的影响已成为分子生物学研究热点,特别是其对肿瘤形成、发展和防治的影响已受到广泛关注。蛋白质组学技术的发展,如二维电泳、质谱、HPLC等,为我们研究这些相互作用的复合物打下了很好的基础。同时,本实验室首创的稳定同位素标记技术（amino acid-coded mass tagging,AACT）技术,也将为相互作用复合物的研究添砖加瓦。本论文主要以质谱为基础的细胞培养的稳定同位素标记技术（AACT）作为蛋白质组学研究的定量技术平台,选择了具有相同遗传学背景的正常肝细胞7701与肝癌细胞7703,详细研究了DNA损伤修复信号通路上的两个关键蛋白H2AX、RAD52的蛋白相互作用复合物的组成变化情况。第一章的第一部分综述了DNA损伤修复通路的研究情况,特别是与DNA双链断裂相关的DNA损伤修复通路,重点介绍了DSB相关的一些重要的修复蛋白及其复合物的作用方式;并探讨了DNA损伤修复蛋白与肿瘤的关系。第二部分介绍了目前大规模研究蛋白质相互作用的有关技术,引入我们的研究技术平台。通过这两部分的内容介绍了本论文的研究背景。文中最后阐述了本论文的研究目的和意义。论文的研究工作主要包括两个部分,分别研究与H2AX、RAD52相关的相互作用复合物的表达情况,分述如下:（一）蛋白质组学解析H2AX相关的蛋白相互作用复合物的研究H2AX是组蛋白H2A的一种变体,于1980年首次在人类细胞中被识别为核心蛋白H2A的同形物,随后于80年末得到测序。研究发现,DNA损伤后核心组蛋白的化学修饰能引起染色质结构的改变,从而促进DNA的修复。组蛋白H2A家族包括H2A1、H2A2、H2AZ和H2AX,其中H2AX在H2A中含量很少,但在DNA损伤信号的分子感应和染色质代谢中发挥至关重要的作用。当电离辐射和其它因素使DNA发生双链断裂（DNA double-strand breaks,DSBs）或者细胞自身代谢产生的DNA DSBs时,H2AX快速发生磷酸化,引起相应信号通路的改变,富集DNA损伤修复相关的蛋白,修复相应DNA损伤。研究发现DSBs损伤修复复合物的组成性活化,是肿瘤形成早期所激活的细胞内可诱导的抗癌屏障,其信号网络的精确、精细调控在基因组稳定性维持中发挥重要作用。为了深入了解这一过程,本章采用氨基酸同位素代谢标记和表位标记的双标记策略（AACT）,分别构建了稳定表达带有标签的H2AX的7701和7703稳定细胞系为研究对象,并结合免疫共沉淀、高效液相色谱、质谱等实验方法,从整体上全面的研究了与H2AX蛋白相互作用的蛋白复合物在正常肝细胞与肝癌细胞中的表达情况,并研究其主要作用方式,尝试了解每一个蛋白在信号通路的功能。表位标记的方法提高了免疫沉淀效率,增加蛋白复合物富集,提高鉴定的效率;而以质谱为基础的氨基酸同位素代谢标记的定量方法可以有效去除非特异性结合蛋白,并实现蛋白间的定量。借助这种策略,我们构建了三个实验组,分别鉴定在7701中与H2AX相互作用的蛋白质、在7703中与H2AX相互作用的蛋白质、在7701和7703同时表达的蛋白质的量的变化。质谱数据分析的结果显示,除了靶蛋白外,我们在7701细胞和7703细胞中分别独立鉴定到85和145个相互作用的蛋白质,在7701细胞和7703细胞定量组中鉴定更多的蛋白,包括了几乎所有在7701和7703单独鉴定到的蛋白。我们在论文的有关部分详细讨论了这一结果。在鉴定到的蛋白质中包括已知相互作用的蛋白如PRAP-1、KU70、组蛋白H4等多个蛋白;以及许多未经报道的蛋白,如CFL、PPMlG及一些核糖体蛋白等被首次报道。对于鉴定到的部分蛋白,我们进行了Western blot、激光共聚焦显微镜扫描验证,结果与质谱结果一致。此外,我们探讨了这些蛋白在信号通路中的功能及作用方式。对于鉴定到的全部蛋白质,进行了生物学功能分类分析。发现鉴定到的蛋白涉及多种生物功能,包括细胞周期、凋亡、DNA代谢和RNA代谢外,还涉及糖代谢、电子转移、多种辅酶系统等等,进一步证明肿瘤的发生是一个多基因参与的过程。之后,我们检测了在博来霉素刺激条件下,鉴定到的蛋白的结合量的变化情况,结果显示PARP-1、KU70、HSP60、CFL等结合量上升,进一步证明了这些蛋白参与了DNA损伤修复。在我们的实验中还尝试了同一体系中比较相互作用复合物的量的变化的新方法。我们将构建好的H2AX带有标签的稳定细胞株7701/7703细胞进行稳定同位素标记,同相应的构建好的非稳定同位素标记的H2AX带有标签的稳定细胞株7703/7701混合完成实验,最后通过对所带标签的质谱定量结果的同一化,得到相同蛋白在不同细胞中的表达量的相对定量。因为使用了同一遗传背景的细胞,所以有效避免了不同个体混合带来的差异。结果显示,许多基因在复合物中的结合量是不同,提示正常肝细胞和肝癌细胞在DNA修复通路上存在差异。最后,通过对本组建立的一个肝癌动物模型的组织切片的免疫组织化学分析,比较了在从正常肝细胞到肝癌这一过程中部分DNA损伤修复相关蛋白的变化情况,研究了它们在肝癌发生发展中的变化情况,希望能找到有潜在临床意义的肿瘤标志物。（二）蛋白质组学解析RAD52相关的蛋白相互作用复合物的研究RAD52属于RAD52家族,目前已发现成分有RAD50、RAD51、RAD51B、RAD52、RAD54、RAD55、RAD57、RAD59等,还不断有新成分被发现。RAD52主要通过DNA的同源重组（HR）与非同源末端连接修复DSBs。新的研究发现RAD52可能在DNA损伤修复的多个环节起作用,并与多种DNA损伤修复相关的蛋白质的活化有密切关系。本章运用了与上一章相同的策略,采用氨基酸同位素代谢标记和表位标记的双标记策略,构建了稳定表达带有标签的RAD52的7701细胞系和7703稳定细胞系,并结合免疫共沉淀、SDS-PAGE,LC-MS的实验方法,研究了与RAD52蛋白相互作用的蛋白复合物在正常肝细胞与肝癌细胞中的表达情况。同样的,我们将实验分为三组,分别在7701细胞中鉴定到了与RAD52相互作用的复合物89个,在7703细胞中鉴定到了与RAD52相互作用的复合物129个;同时在定量组中鉴定到在7701细胞中与RAD52结合量上调的蛋白60个,在7703细胞中与RAD52结合量上调的蛋白90个。对于鉴定到的全部复合物进行了详细的功能分类,发现这些蛋白的功能主要集中在对生物合成、细胞间代谢、糖分解代谢、细胞防御反应、凋亡、核酸代谢、细胞定位、氨基酸代谢、羧酸代谢、细胞蛋白代谢、化学刺激的反应物等方面。通过比较7701细胞与7703细胞中这些复合物功能异同发现,7703细胞中鉴定到了一类抗凋亡蛋白,而7701中鉴定到了一类与防御相关及对化学刺激防御的应答蛋白。这一结果提示在正常的肝细胞和癌细胞中DNA修复复合物确实不同,正常细胞的DNA修复复合物倾向于维持基因组的稳定性,保持细胞内部的稳态平衡;癌细胞则倾向于对错误修复的逃逸,造成细胞的永久性生长。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 DNA损伤修复
• 1.1 细胞内主要的DNA损伤修复途径
• 1.2 DNA双链断裂的损伤修复
• 1.2.1 引起DNA双链断裂的原因
• 1.2.2 DNA双链断裂的修复方式
• 1.2.2.1 同源重组（homologous recombination）
• 1.2.2.2 非同源重组
• 1.2.2.3 同源重组与非同源末端连接的比较
• 1.3 修复通路间的相互作用
• 1.4 DNA损伤修复与肿瘤的关系
• 2 大规模蛋白质相互作用研究方法
• 2.1 酵母双杂交
• 2.2 噬菌体展示
• 2.3 蛋白质芯片
• 2.4 串联亲和纯化技术
• 2.5 基于质谱的稳定同位素标记技术
• 2.6 基于生物信息学的分析方法
• 3 本论文的选题目的及意义
• 参考文献
• 第二章 蛋白质组学解析H2AX相关的蛋白相互作用复合物的研究
• 1 引言
• 2 实验部分
• 2.1 化学试剂、细胞及抗体
• 2.2 稳定细胞株的构建
• 2.3 稳定细胞株的鉴定
• 2.4 细胞培养、体内标记及实验分组
• 2.5 蛋白提取和蛋白复合物的纯化
• 2.6 SDS-PAGE考染及胶内酶解、提肽
• 2.7 酶解肽段的液相色谱分离
• 2.8 数据库搜索和蛋白鉴定
• 2.9 免疫印迹
• 2.10 激光共聚焦显微镜扫描
• 2.11 博来霉素刺激实验
• 2.12 肝癌动物模型的建立
• 2.13 免疫组织化学染色
• 3 结果与讨论
• 3.1 稳定细胞株的构建
• 3.2 稳定同位素标记的双标签鉴定策略
• 3.3 7701细胞中H2AX相互作用复合物的蛋白质组分析
• 3.3.1 H2AX相互作用复合物的差异表达蛋白组分鉴定和定量分析
• 3.3.2 7701细胞中定量鉴定到的H2AX蛋白复合物的验证
• 3.3.2.1 7701细胞中H2AX相互作用复合物的蛋白表达分析
• 3.3.2.2 7701细胞中H2AX相互作用复合物的细胞定位研究
• 3.3.3 7701细胞鉴定到的H2AX蛋白复合物的功能分类
• 3.3.4 7701细胞H2AX蛋白复合物的功能研究
• 3.4 7703细胞中H2AX相互作用复合物的蛋白质组分析
• 3.4.1 H2AX相互作用复合物的差异表达蛋白组分鉴定和定量分析
• 3.4.2 7703细胞中定量鉴定到的H2AX蛋白复合物的验证
• 3.4.2.1 7703细胞中H2AX相互作用复合物的蛋白表达分析
• 3.4.2.2 7703细胞中H2AX相互作用复合物的细胞定位研究
• 3.4.3 7703细胞内H2AX蛋白复合物的功能分类
• 3.4.4 7703细胞H2AX蛋白复合物的功能研究
• 3.5 比较H2AX相百作用复合物在7701细胞和7703细胞中的表达变化
• 3.5.1 H2AX相互作用复合物在tag—7701/tag—7703混合组的表达和定量分析
• 3.5.2 验证H2AX相互作用复合物在正常细胞与肝癌细胞的结合情况
• 3.5.3 比较H2AX相瓦作用复合物在正常细胞与肝癌细胞的功能分类情况
• 3.5.4 动物模型病理免疫组化揭示部分相互作用蛋白与肝癌发生发展的关系
• 3.6 H2AX相互作用的蛋白功能解析
• 3.6.1 PARP-1
• 3.6.2 KU70
• 3.6.3 HSP60
• 3.6.4 PCNA
• 3.6.5 14-3-3 zeta
• 3.6.6 CFL
• 3.6.7 VCP
• 4 结论
• 参考文献
• 第三章 蛋白质组学解析RAD52相关的蛋白相瓦作用复合物的研究
• 1 引言
• 2 实验部分
• 2.1 化学试剂、抗体和仪器
• 2.2 稳定细胞系的构建
• 2.3 稳定细胞系的鉴定
• 2.4 细胞培养、体内标记及实验分组
• 2.5 蛋白提取和RAD52蛋白复合物的纯化
• 2.6 SDS-PAGE考染的胶内酶解
• 2.7 酶解肽段的液相色谱分离
• 2.8 数据库搜索和蛋白鉴定
• 3 结果与讨论
• 3.1 稳定细胞株的构建
• 3.2 稳定同位素标记的双标签鉴定策略
• 3.3 RAD52相互作用复合物的差异表达蛋白组分鉴定和定量分析
• 3.4 RAD52蛋白复合物的功能分类
• 3.4.1 RAD52相互作用复合物在正常细胞7701的功能分类
• 3.4.2 RAD52相互作用复合物在肝癌细胞7703的功能分类
• 3.4.3 比较RAD52相互作用复合物在正常细胞与肝癌细胞的功能分类情况
• 4 结论与展望
• 参考文献
• 致谢