大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及对T淋巴细胞免疫功能的影响

论文摘要

近年来的研究发现,骨髓间充质干细胞具有可塑性,在特定的条件下可分化为各胚层来源的组织细胞,称为横向分化（transdifferentiation）,这一发现不仅对于细胞生物学理论的发展有重大意义,对于各种因素导致的组织和器官病变以及遗传缺陷性疾病的细胞替代治疗也具有深远的影响。由于骨髓MSCs易于分离培养和体外扩增,可自体移植无免疫排斥反应等特点,因此利用骨髓MSCs横向分化潜能,可以根据需要将其诱导分化为特定的组织细胞,用以修复受损的组织或器官,这也将为免疫功能紊乱的治疗提供了另一条途径。在骨髓MSCs应用过程中,它与血管内皮细胞或组织细胞及细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的粘附是发挥修复治疗作用的第一步。研究证明,粘附分子在细胞与细胞、细胞与细胞外基质间粘附过程中起着重要的作用。因此,探讨骨髓MSCs的黏附分子的生物学及分子学基础就显得尤为重要。近年来愈来愈多的研究还显示了MSCs具有免疫调节特性,使其在免疫抑制方面具有可预期的理论意义和使用价值。就此,本课题第一部分系统研究了骨髓MSCs的分离培养、体外扩增及黏附分子测定,第二部分重点研究了骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞免疫功能的影响。试验一:大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及黏附分子测定目的:探讨体外分离培养和扩增大鼠间充质干细胞（MSCs）的最佳条件,并对其进行表型鉴定及黏附分子测定。方法:采用全骨髓直接贴壁法获得原代大鼠骨髓MSCs,差速贴壁结合消化控制法纯化细胞,Ⅰ型胶原作为细胞外基质扩增MSCs;镜下观察细胞生物学形态及生长状态,流式细胞仪检测第4代MSCs的细胞周期,免疫细胞化学方法对其进行表型鉴定与细胞黏附分子检测。结果:原代培养的MSCs呈圆形、梭形、多角形等,24 h内即可见少量细胞体壁伸展,7～8 d左右可达90%融合,纯化扩增后的MSCs呈均匀一致的长梭形,24 h内细胞已基本贴壁,传代周期为5 d左右。流式细胞仪检测显示,第4代MSCs约有80%处于G0/G1期。免疫细胞化学显示,MSCs CD34、CD45表达阴性,CD29、CD105、CD166、VLA-4、P-selectin表达阳性。结论:本实验方法能很容易地获得大量高纯度的MSCs,并表达一定的黏附分子,为MSCs进一步临床应用打下了良好的基础。试验二:骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞免疫功能的影响目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞免疫功能的影响方法:采用试验一的方法分离获得MSCs,尼龙棉柱法从外周血分选出T淋巴细胞; MTT法测定MSCs对T淋巴细胞增殖的影响。结果:MSCs形态均匀一致,生长曲线显示增殖能力强;尼龙棉柱法分离的单个核细胞其CD3阳性细胞高表达。MSCs各组及其上清与T淋巴细胞共培养,其增殖百分率呈明显下降趋势。结论:实验能获得性能可靠的MSCs及T淋巴细胞;MSCs及其上清对T淋巴细胞增殖表现为抑制效应并呈剂量及浓度依赖性。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 试验一 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及黏附分子测定
• 前言
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 实验器材
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 培养瓶的处理
• 2.2 MSCs 的分离培养
• 2.3 镜下形态学观察
• 2.4 生长曲线的测定
• 2.5 流式细胞术检测
• 2.6 免疫细胞化学染色
• 3 结果
• 3.1 MSCs 的形态学变化
• 3.2 生长曲线的测定
• 3.3 MSCs 的细胞周期
• 3.4 MSCs 的表型鉴定及黏附分子测定
• 4 讨论
• 附图
• 试验二 骨髓间充质干细胞对T 淋巴细胞免疫功能的影响
• 1 材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 试验器材
• 1.3 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 大鼠骨髓MSCs 的分离、培养
• 2.2 MSCs 的形态学观察
• 2.3 骨髓MSCs 细胞计数法生长曲线的测定
• 2.4 骨髓MSCs 表面标志检测
• 2.5 大鼠T 淋巴细胞的分离
• 2.6 MSCs 对PHA 刺激的T 淋巴细胞增殖的影响
• 2.7 MSCs 上清对PHA 刺激的T 淋巴细胞增殖的影响
• 3 结果
• 3.1 原代细胞培养的生长曲线
• 3.2 MSCs 细胞表面分子的鉴定
• 3.3 MSCs 及其上清抑制T 淋巴细胞的增殖
• 4 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介及研究生期间发表的文章