论文摘要
背景黑斑息肉综合征（Peutz-Jeghers syndrome, PJS）是一种常染色体显性遗传性疾病,以皮肤粘膜黑色素斑点、胃肠道多发性息肉和消化道外多发肿瘤为特征。胃肠道多发息肉经手术切除治疗后复发率高。既往研究认为PJS息肉病理属于错构瘤,癌变可能性小。近年有报道PJS息肉为腺瘤样息肉,癌变风险率较高,即存在由“错钩瘤→腺瘤→腺癌”演变过程,但未从基因及其表达水平研究其真实性。PJS患者不仅存在消化道息肉的癌变风险,而且常伴胃肠道外器官（胰腺、卵巢、睾丸、乳腺、子宫、肺等）肿瘤,其家族的癌症发病率也较普通人群为高。临床上PJS主要表现为胃肠道多发性息肉,腹部症状以反复肠套叠、消化道出血和腹痛为主,PJS息肉可发生在胃肠道任何部分,以空肠和回肠为主,其次是结肠和胃。PJS是一种中等度癌变风险的遗传性大肠癌综合征,癌变缓慢,其恶变机制未完全阐明,尚无干预措施能根治和预防PJS发病及演变。PJS的主要致病基因是LKB1,研究报道有大约30-67%的PJS存在LKB1基因的胚系突变,小部分存在体细胞突变,且有明确家族史的PJS患者中只有10%-20%可能由于de novo LKB1胚系突变引起。这种遗传异质性意味着仍有相当一部分的PJS无法单独用LKB1突变来解释。Nicholas在迄今最大规模的临床研究中（419位PJS患者）发现,LKB1的突变与PJS癌变发生率并不相关,Hamid对于46个PJS家系的研究也证实了此观点,高度提示还有其它基因参与了PJS演变的过程。DNA错配修复（mismatch repair system, MMR）系统是人体细胞中一种能识别并修复DNA碱基错配的安全保障系统,维持DNA复制的高保真性。直到目前,从人体细胞中一共分离克隆到9种MMR基因,分别是hMLH1、hMSH2、 hMSH5、hMSH6、hMSH4、hMSH3、hPMS1、hPMS2、hMLH3,它们识别并修复DNA在复制过程中出现的基因的缺失、插入、点突变等。错配修复基因（mismatch repair gene, MMR）与遗传性非息肉性结直肠癌（hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC）密切相关。现已证明,hMLH1和hMSH2蛋白表达异常及其功能缺陷是遗传性非息肉性大肠癌（HNPCC）的发病原因。hMSH2基因含有2727bp的开放阅读框架,一种由909个氨基酸序列组成的蛋白质是由其翻译后编码的,其中85%与酵母蛋白的相应区域是一致的。1hMLH1基因含2268bp阅读框架,编码756个氨基酸残基。其启动子甲基化可导致MMR缺陷,近年来的研究发现,hMLH1的失活与肿瘤的发生与发展有关,其中与大约30%的]HNPCC发病有关。错配修复基因发生突变,可产生带有缺陷的错配修复蛋白,错配修复功能异常,导致微卫星不稳定或者DNA的复制错误,从而增加了细胞基因组的不稳定,引起细胞的增殖和分化异常,促使多种恶性肿瘤发生。研究发现,遗传性非息肉病性大肠癌（HNPCC）特征性的表现为DNA错配修复基因（MMR基因）的突变导致DNA复制错误（RER）及不稳定（MSI）。PJS癌变缓慢,其与遗传性非息肉病性大肠癌（HNPCC）有类似的临床病理特征：（1）发病年龄较轻；（2）易发生肠内及肠外其它器官的多发性肿瘤；（3）具有高突变性,与生长调控、凋亡相关基因突变数目明显增多；（4）较少发生转移、易局限,预后较好。对]HNPCC高恶性基础却低恶性表型,一种未被充分证实的解释为RER肿瘤的基因突变频发,使其转移侵袭受阻。据此有必要研究PJS与MMR基因的相互关系,从基因及其表达水平研究其真实性；进而引入PJS息肉演变机制研究。研究目的本课题在先期工作基础上,首先研究PJS组织中MMR基因hMLH1、hMSH2的表达,探讨PJS组织中1ML1、hMSH2的活性状态,进而结合LKB1的表达探讨它们之间可能的相互关系。旨在从一个新的方向来研究PJS的发病及恶变机制,以期为PJS综合征早期诊断、癌变风险评估,及其预防提供理论依据。另外通过对正常肠粘膜组织、结肠腺瘤及结肠腺癌组织中3种分子的表达分析,探讨它们在不同组织中的表达情况及演变趋势。材料与方法1、用real-time PCR检测LKB1、hMLH1、hMSH2 mRNA:取18例PJS错构瘤、18例结直肠腺瘤、18例结直肠腺癌、18例癌旁正常肠粘膜组织,提取新鲜组织总RNA,针对其基因CDS区设计引物,通过逆转录及实时荧光定量PCR方法检测LKB1、hMLH1、hMSH2 mRNA表达水平。2、在连续切片上用免疫组化法检测LKB1、hMLH1、hMSH2蛋白：取25例PJS错构瘤、25例结直肠腺瘤、25例结直肠腺癌、25例癌旁正常肠黏膜组织的石蜡标本,通过免疫组织化学法在同一组织来源标本的连续切片中检测hMLH1、hMSH2、LKB1蛋白的表达部位及染色程度。3、统计方法：采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。计量资料的多组独立样本比较,采用单向方差分析（One-way ANOVA）;如果资料不符合正态分布或是多组等级资料,采用秩和检验方法（Kruskal-WallisH）。hMSH2、 LKB1三者中两两者之间表达水平的相关关系采用双变量相关分析。以双侧α=0.05作为检验水准,检验标准以P<0.05为有显著性差异或有相关关系。r相关系数表示两两之间相关关系的密切程度。结果1、Real-time PCR结果显示在mRNA水平,hMLH1、hMSH2在PJS息肉组织的相对表达量分别为0.68±0.62、0.71±0.62,比正常组（0.96±0.65、0.98±0.65）低,差异具有统计学意义；高于腺瘤组（0.45+0.87、0.33±0.75）和腺癌组（0.35±0.78、0.23±0.87）,差异有统计学意义。LKB1在PJS组的相对表达量分别为2.72+1.06,高于正常组（1.62±0.65）,低于结肠腺瘤组（4.32±2.59）和结肠腺癌组（7.84±3.26）,与腺瘤组的差异无统计学意义。2、免疫组化结果显示hMLH1和hMSH2两种蛋白在四种组织的表达主要局限于上皮细胞基底层,亚细胞定位主要在细胞核,也可见于胞浆、胞膜；正常组中hMLH1和hMSH2蛋白主要表现为强表达（15/25,17/25）或微弱表达（8/25,7/25）,hMLH1和hMSH2蛋白在腺癌组的胞核染色减弱。LKB1蛋白在PJS组的表达有两种不同模式,一种表现为腺体上皮细胞的胞膜、胞浆染色,另一种表现为蛋白表达缺失,相应的hMLH1和hMSH2蛋白较LKB1表达组染色强度增加。腺瘤组和腺癌组的蛋白表达与细胞的异型性有关,细胞形态正常区域hMLH1和hMSH2的表达相对强于异型细胞分布区域,而LKB1的表达相对弱于异型细胞分布区域。3、hMLH1蛋白在正常粘膜组的平均秩为70.28,在PJS组的平均秩为60.84,PJS组的hMLH1染色强度明显低于正常粘膜组,差异具有统计学意义（P=0.019）。hMSH2蛋白在正常粘膜组的平均秩为73.20,在PJS组的平均秩为56.76,PJS组的hMSH2染色强度明显低于正常粘膜组,差异具有统计学意义（P=0.009）。LKB1蛋白在正常粘膜组的平均秩为32.02,在PJS组的平均秩为48.50,差异具有统计学意义（P=0.039<0.05）。多组间的比较结果显示正常肠粘膜组织、PJS错构瘤息肉、结肠腺瘤及结肠腺癌四组间hMLH1和hMSH2、LKB1蛋白的阳性表达率和表达程度的差异均具有统计学意义（P<0.05）。其中hMLH1和hMSH2二者在正常肠黏膜组的阳性表达率和表达强度最高,其后依次是PJS组、结肠腺瘤组、结肠腺癌组。LKB1在正常肠黏膜组的阳性表达率和表达强度最低,在PJS组、结肠腺瘤组、结肠腺癌组依次呈上升趋势,组间两两比较PJS组和腺瘤组之间差异无统计学意义（P>0.05）。4、相关性分析：在mRNA水平,LKB1、hMLH1相关系数r=-0.732（P<0.01）；LKB1、hMSH2相关系数r=-0.834（P<0.05）,hMLH1、hMSH2相关系数r=1.000（P<0.05）；在蛋白水平,LKB1、hMLH1相关系数r=-0.637 （P<0.05）; LKB1、 hMSH2相关系数r=-0.653（P<0.01）；1iMLH1、hMSH2相关系数r=0.967（P<0.01）。LKB1分别与hMLH1、hMSH2的表达量呈显著负性相关,hMLH1、hMSH2呈显著正性相关,三者中两两之间相关关系密切。结论1、PJS息肉中hMLH1和hMSH2的表达较正常肠粘膜组织下降,而高于腺瘤组、腺癌组,二者在癌旁正常粘膜、P-J息肉、腺瘤、腺癌组织呈梯度下降趋势,提示MMR基因缺陷导致的蛋白表达缺失在PJS瘤变过程中可能是一个早期事件。2、癌旁正常粘膜、P-J息肉、腺瘤及腺癌组织中hMLH1及hMSH2分别与LKB1的表达水平之间呈负性相关关系。提示LKB1与错配修复基因间有可能存在着相互作用。3、LKB1蛋白在P-J息肉中的染色具有多样性,反映了PJS的遗传异质性。其中,LKB1失表达的P-J息肉中MMR表达水平略有增强,推测LKB1可能受到MMR的调节。