多基因植物表达载体构建方法的研究

论文摘要

随着基因工程技术的发展,动植物品种特性的改良越来越多的需要靠转化多个基因来实现,于是杂交法、分次转化法、共转化法等多基因转化方法应运而生。但目前为止,所有这些方法都存在着费时、繁琐、转化效率低、需要不同的筛选标记基因等缺点。将多个基因串联在同一表达载体上进行一次性转化则显得非常有优势。然而,构建含有两个或多个基因表达盒的载体目前依然存在着许多困难。由于同尾酶酶切可获得相同的粘性末端,重组连接后,重组位点上原酶切位点消失,不能再被原同尾酶切开。本研究利用同尾酶这一特点,发明了一种简单易用的新方法,成功解决了多基因聚合技术这一难题,理论上可在同一载体上连接无限个基因表达盒。首先以pCR2.1-TOPO（invitrogen）为骨架,构建了一个上游带35S启动子,下游带Tnos终止子,两者之间为多克隆位点序列（MCS）的辅助载体pCR（-XbaI-35S-MCS-Tnos-SpeI-XbaI-）。目的基因1、2、3…分别亚克隆到该辅助载体的MCS上,相应带有目的基因的重组质粒分别命名为pCREC1、pCREC2、pCREC3…。这样每个基因表达盒两端都带有XbaI位点,并且在Tnos终止子与下游的XbaI酶切位点之间有一个SpeI酶切位点。由于XbaI和SpeI是同尾酶,二者酶切后可获得相同的粘性末端。所以XbaI酶切pCREC2得到基因表达盒EC2,可连接到pCREC1的SpeI位点上,得到带有两个基因表达盒的新质粒pCR（-XbaI-EC1-SpeI/XbaI -EC2 -SpeI-XbaI-）。又由于新连入的EC2 3?末端仍然带有一个SpeI酶切位点,从而可以再连接由XbaI从pCREC3质粒酶切而来的第三个基因表达盒EC3。利用这种方式,可以依次连入多个基因表达盒。最后用XbaI从该辅助载体上酶切下构建好的包含多个基因表达盒的DNA片段,连接到植物双元表达载体pCambia2300上,从而获得包含多个基因表达盒的植物表达载体。为了验证此方法的可行性,我们构建了含有报告基因GUS、GFP及筛选标记基因BAR的3基因表达载体pCambia3EC,同时我们还将此法应用到长链不饱和脂肪酸EPA/DHA（鱼油的主要有效成分）的植物反应器研究中,构建了包含EPA合成代谢途径中的4个关键基因的植物表达载体pCambia4EC,并初步进行了拟南芥转化验证。PCR及酶切鉴定证明构建的表达载体带有全部目的基因。我们分别把两个表达载体转化到根癌农杆菌GV3101中,并且进行了拟南芥遗传转化,26棵三基因和58棵四基因转基因拟南芥分别在除草剂和卡那霉素培养基上检测出,转基因情况正在鉴定之中。以上研究结果表明:此法不但理论上简单可靠,实践上也简单可行。通过设计,我们仅用两个同尾酶XbaI和SpeI就解决了多基因聚合载体的构建难题,为今后科学研究与基因工程改良植物的生产实践提供了一种简单、易用、灵活、可靠、低成本的多基因表达载体构建的新方法。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 植物多基因聚合技术的研究进展
• 1.1.1 多基因聚合的方法
• 1.1.1.1 杂交法
• 1.1.1.2 多个表达载体多次转化法
• 1.1.1.3 多个表达载体的共转化法
• 1.1.1.4 多基因单表达载体一次性转化法
• 1.2 独立表达盒法构建多基因表达载体的研究进展
• 1.2.1 借助稀有归巢内切酶的方法
• 1.2.2 利用Cre/LoxP重组系统的方法
• 1.2.3 基于Gateway技术的方法
• 1.3 超长链多不饱和脂肪酸研究进展
• 1.3.1 超长链多不饱和脂肪酸的重要意义
• 1.3.2 超长链多不饱和脂肪酸的来源
• 1.3.3 超长链多不饱和脂肪酸的生物合成途径
• 1.3.4 超长链多不饱和脂肪酸在转基因植物中的合成
• 1.4 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 PCR引物
• 2.1.4 酶及生化试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 基因组DNA提取
• 2.2.2 植物RNA的提取
• 2.2.3 RNA甲醛变性胶电泳检测
• 2.2.4 反转录cDNA第一链的合成
• 2.2.5 PCR扩增各目的基因
• 2.2.6 连接反应
• 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的转化
• 2.2.9 单菌落PCR的检测
• 2.2.10 碱法小量提取质粒DNA
• 2.2.11 质粒DNA的酶切鉴定
• 2.2.12 去磷酸化
• 2.2.13 DNA片段的回收
• 2.2.14 序列测定
• 2.2.15 农杆菌感受态的制备及转化
• 2.2.15.1 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备
• 2.2.15.2 根癌农杆菌GV3101电转化感受态制备
• 2.2.15.3 冻融法转化农杆菌
• 2.2.15.4 电击法转化农杆菌
• 2.2.16 农杆菌介导的拟南芥遗传转化
• 2.2.17 转基因植株分析
• 3 结果与分析
• 3.1 供给载体的构建
• 3.2 目的基因亚克隆入供给载体
• 3.2.1 Δ9Elo的亚克隆
• 3.2.2 Δ8Des的亚克隆
• 3.2.3 Δ5Des的亚克隆
• 3.2.4 Δ15Des的亚克隆
• 3.2.5 GUS的亚克隆
• 3.2.6 GFP的亚克隆
• 3.2.7 BAR的亚克隆
• 3.3 多基因表达盒的组装
• 3.3.1 EPA合成表达载体的组装
• 3.3.1.1 过渡载体pCRΔ9Δ8Δ5Δ15的组装
• 3.3.1.2 EPA 表达载体的构建
• 3.3.2 报告基因表达载体的组装
• 3.3.2.1 过渡载体pCRGUSGFPBAR 的组装
• 3.3.2.2 表达载体pCambia3EC 的构建
• 3.4 转基因拟南芥的获得
• 4 讨论
• 4.1 杂交法
• 4.2 分次转化法
• 4.3 共转化法
• 4.4 多基因单表达载体一次性转化法
• 4.5 本方法的特色及创新之处
• 4.6 展望
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢