牦牛中性粒细胞抗菌肽分离纯化、LAP基因克隆及原核表达

论文摘要

内源性抗微生物肽是生物体内先天性免疫的重要组成成分,防御素（defensins）是广泛分布于动物和植物界的一类富含半胱氨酸的阳离子内源性抗微生物肽,是内源性抗微生物肽中的一个大家族。是由生物细胞特定基因编码,经特定外界条件诱导产生的一类多肽,具有抵抗外界微生物侵害、消除体内突变细胞的作用。根据防御素分子内半胱氨酸的位置和连接方式、前体性质及表达位置的差异可分为α-防御素、β-防御素、θ-防御素、昆虫防御素和植物防御素五种类型。β-防御素主要分布于哺乳动物的黏膜上皮细胞内,所以,β-防御素被确认为黏膜表面抗微生物屏障的组成成分。本试验以牦牛为实验材料,无菌采血,用40%聚蔗糖和76%复方泛影葡胺按一定比例配制成细胞分层液,以确定牦牛中性粒细胞及其他主要血细胞的漂浮密度。然后配制Percoll分层液通过密度梯度离心法分离纯化牦牛中性粒细胞,用5%的冰乙酸抽提结合高速离心获得中性粒细胞粗提物,并进行了体外抑菌活性、溶血和对血细胞凝集的活性测定。活性检测结果表明,牦牛中性粒细胞粗提物对三种测试菌有很强的抑菌活性,对兔和绵羊红细胞没有发生溶血现象,对兔血细胞稍有凝集（+）而对绵羊红细胞无凝集。对牦牛中性粒细胞粗提物进行了分离纯化。通过Bio-Gel P-10凝胶过滤和反相高效液相色谱（RP-HPLC）,收集到牦牛中性粒细胞提取物样品共22个峰,其中检测出9个抑菌活性峰。选取有抑菌活性的9个峰进行了质谱分析。在试验中我们以牦牛为材料,从牦牛舌黏膜上皮组织中提取总RNA,根据反刍动物—牛β-防御素cDNA的保守序列设计了一对引物,采用RT-PCR技术扩增出yLAP的cDNA,并重组到pGM-T载体,经限制性内切酶图谱分析后进行DNA序列测定,测序结果证实所克隆的yLAP的cDNA为β-防御素,因为该cDNA包含一个由192个碱基组成的开放读码框（Open Reading Frame,ORF）,该ORF编码64个氨基酸残基的前原防御素肽,该前原防御素肽含有β-防御素的特征性结构,即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基。通过计算机软件分析其碱基分布、核苷酸和氨基酸同源性等。结果表明,yLAP基因与GenBank中已报道序列的同源性为99%;将yLAP和其他哺乳动物β-防御素进行cDNA碱基序列和前原肽氨基酸序列的同源性比较分析,结果显示:yLAP与驯鹿、山羊和水牛的β-防御素序列一致性最高（91.7%,88.5%,93.1%）,与猪、驴和马的β-防御素之间的次之（64.5%～73.3%）,与犬和恒河猴的β-防御素的最低（在30%以下）。由此可以看出yLAP的cDNA序列与驯鹿、山羊和水牛的β-防御素亲缘关系较近,这说明防御素进化的多样性。再以重组质粒为模板,用特异性表达引物扩增得到目的基因:即编码yLAP的CDS片段（207bp）,将其定向克隆到pET-28a（+）表达载体中,构建的原核表达质粒pET-yLAP转化大肠杆菌BL21（DE3）,结果表明,成功表达出17KDa左右的目的蛋白。经优化实验,确定最佳诱导表达条件为终浓1mmol/L的IPTG在37℃,pH值7.2条件下诱导表达6h。SDS-PAGE进行检测,表达量平均占菌体总蛋白的31.5%,以包涵体的形式存在。琼脂扩散实验检测表达产物的体外抑菌活性,在大肠杆菌中表达的牦牛β-防御素具有体外抑菌活性。牦牛β-防御素的发现有利于对牦牛黏膜的防御机制进行进一步的研究,同时丰富了牦牛功能基因的研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写词表
• 文献综述
• 第一章 抗菌肽的研究进展
• 引言
• 1.1 抗菌肽的发现简况
• 1.2 抗菌肽的分类
• 1.2.1 根据来源将其分为以下几类
• 1.2.2 根据合成的部位可分为两类
• 1.2.3 根据结构分类
• 1.2.4 根据生物活性分类
• 1.2.5 根据所带电荷分类
• 1.3 防御素的分布
• 1.3.1 α-防御素
• 1.3.2 β-防御素
• 1.3.3 θ-防御素
• 1.4 防御素的分子特征
• 1.4.1 α-防御素
• 1.4.2 β-防御素
• 1.4.3 θ-防御素
• 1.4.4 昆虫防御素
• 1.4.5 植物防御素
• 1.5 抗菌肽的作用机理
• 1.6 结构和功能关系
• 1.6.1 正电荷对低聚反应的作用
• 1.6.2 二硫化物排列的作用
• 1.6.3 其它结构模式的作用
• 1.6.4 防御素的活性与肽链个别氨基酸残基关系
• 1.7 防御素的生物学活性
• 1.7.1 抗细菌作用
• 1.7.2 抗病毒作用
• 1.7.3 抗真菌作用
• 1.7.4 防御素的抗肿瘤作用
• 1.7.4.1 防御素直接抗肿瘤作用
• 1.7.4.2 防御素间接抗肿瘤作用
• 1.7.5 防御素对免疫细胞的作用
• 1.7.6 防御素的趋化活性
• 1.8 防御素的应用前景
• 1.8.1 在医药领域的应用
• 1.8.2 食品工业中的应用
• 1.8.3 在动植物抗病育种中的应用
• 1.8.4 抗菌肽作为饲料添加剂在畜牧业中的应用
• 1.9 本研究的目的、意义及研究方法
• 1.10 结束语
• 研究内容
• 第二章 牦牛中性粒细胞防御素的提取与生物活性测试
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 实验用菌种
• 1.1.3 实验试剂
• 1.1.4 实验仪器
• 1.1.5 溶液和培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 牦牛PMN的分离
• 1.2.1.1 测试确定牦牛PMN的漂浮密度
• 1.2.1.2 PMN分离液的配制
• 1.2.1.3 Percoll密度梯度离心法分离
• 1.2.2 中性粒细胞颗粒组分的分离
• 1.2.3 PMN颗粒组分中蛋白的提取
• 1.2.4 抑菌活性检测
• 1.2.5 溶血活性检测
• 1.2.6 血细胞凝集活性检测
• 2 结果
• 2.1 牦牛血液中各种细胞成分的漂浮密度
• 2.2 PMN的纯化分离结果
• 2.3 PMN颗粒组分的分离及其蛋白的提取结果
• 2.4 抑菌活性检测结果
• 2.5 溶血活性检测
• 2.6 血细胞凝集活性检测
• 3 讨论
• 3.1 分离方法的选择
• 3.2 牦牛中性粒细胞粗提物的活性
• 4 小结
• 第三章 牦牛中性粒细胞抗菌肽的分离纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 实验用菌种
• 1.1.3 实验试剂
• 1.1.4 实验仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 牦牛中性粒细胞的获取
• 1.2.2 中性粒细胞粗提物的制备
• 1.2.3 凝胶过滤层析分离
• 1.2.4 样品收集
• 1.2.5 抑菌活性测定
• 1.2.6 反相高效液相色谱（RP-HPLC）
• 1.2.7 抑菌活性测定
• 1.2.8 质谱分析
• 2 结果
• 2.1 Bio-Gel凝胶过滤的分离效果
• 2.2 抑菌活性测定
• 2.3 反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化的效果
• 2.4 活性测定
• 2.5 质谱测试分析
• 3 讨论
• 3.1 防御素的纯化方法
• 3.2 防御素的色谱纯化模式的选择
• 3.3 蛋白质的纯化技术的发展
• 4 小结
• 第四章 牦牛舌上皮组织β-防御素基因yLAP的克隆与序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验动物及其组织
• 1.1.2 菌种与载体
• 1.1.3 酶和主要试剂
• 1.1.4 试剂配制
• 1.1.5 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 牦牛舌上皮组织总RNA的提取及检测
• 1.2.2 yLAP基因的扩增
• 1.2.3 yLAP基因的克隆
• 1.2.4 重组质粒的提取与鉴定
• 1.2.5 RT-PCR产物cDNA的序列测定
• 1.2.6 序列分析
• 2 结果
• 2.1 总RNA提取与检测
• 2.2 RT-PCR扩增产物的电泳检测
• 2.3 yLAP基因的克隆与鉴定
• 2.3.1 重组质粒的电泳鉴定
• 2.3.2 重组质粒的PCR扩增与酶切鉴定
• 2.4 目的基因的序列测定
• 2.5 目的基因的基本性质分析
• 2.6 yLAP基因的核苷酸及氨基酸同源性分析
• 2.7 蛋白质序列的Blast分析
• 3 讨论
• 3.1 牦牛β-防御素yLAP的克隆
• 3.2 牦牛β-防御素yLAP的分析
• 4 小结
• 第五章 牦牛舌β-防御素（yLAP）基因的原核表达及活性测定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验动物及其组织
• 1.1.2 载体及菌种
• 1.1.3 酶和主要试剂
• 1.1.4 主要仪器
• 1.1.5 SDS-PAGE电泳用试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物的设计
• 1.2.2 yLAP基因片段的扩增
• 1.2.3 目的片段与表达载体pET-28a的酶切回收
• 1.2.4 yLAP基因片段与表达载体的连接及转化
• 1.2.5 重组表达质粒的提取与鉴定
• 1.2.6 重组质粒诱导表达
• 1.2.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的检测
• 1.2.8 重组蛋白表达条件的探索
• 1.2.9 pET-yLAP的表达产物的初步纯化
• 1.2.10 用琼脂扩散法检测表达蛋白的体外抑菌活性
• 2 结果
• 2.1 重组表达载体的构建及鉴定
• 2.1.1 yLAP目的基因片段的获得
• 2.1.2 重组表达载体的构建及鉴定
• 2.2 重组表达载体诱导产物的电泳分析
• 2.3 不同诱导条件对重组载体pET-yLAP表达的影响
• 2.4 重组载体pET-yLAP表达蛋白的分离纯化及体外活性的检测
• 2.4.1 溶解性判定试验
• 2.4.2 重组牦牛防御素蛋白的分离、纯化
• 2.4.3 牦牛防御素重组蛋白体外抑菌活性的检测
• 3 讨论
• 3.1 pET-yLAP在大肠杆菌中的表达
• 3.2 表达重组蛋白的初步纯化
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 作者简介
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