细胞色素P450同工酶对马兜铃酸肾毒性的影响

论文摘要

自1993年,比利时Vanherweghem报道服用含马兜铃酸（aristolochic acid,AA）成分的减肥药导致肾脏损害和肿瘤后,含马兜铃酸类中药引起马兜铃酸肾毒性问题便逐渐成为国内、外医药界普遍关注的研究热点。为避免此类药物不良反应的再次发生,美国FDA已从2001年起禁止含马兜铃酸的产品进入美国市场,同时禁止使用可能与含马兜铃酸类中药混淆的品种。国际上还有很多国家禁止进口含马兜铃酸的中药材。国内于2003、2004年也先后发文取消了关木通、青木香、广防已的药用标准,并限制含有马兜铃酸成分的中药及其相关制剂的使用。然而我国仍然还有多种含马兜铃酸成分的中药继续在临床使用,如马兜铃、天仙藤、朱砂莲等。虽然这些品种含的马兜铃酸含量较低,但是由于目前对于马兜铃酸的安全剂量仍然不清楚,因此,深入探讨马兜铃酸毒性机制,搞清楚马兜铃酸毒性的影响因素是非常重要的。临床服用含马兜铃酸中药的人群中,只有约5%出现肾脏毒性。这一现象提示,不同的人对马兜铃酸的敏感性可能存在差异。由于人类的重要药物代谢酶—肝脏细胞色素P450酶存在着基因多态性,不同个体的某些P450同工酶的含量和活性存在很大的差异,因而代谢药物的能力有所不同。马兜铃酸肾脏毒性在不同个体间的差异是否与肝脏代谢酶差异有关,值得深入探讨。此外,有很多药物可影响某些P450同工酶活性,而临床上普遍存在着多种药物联合用药的情况,尤其是化学药与中药合用的情况越来越多。这些具有P450同工酶诱导或抑制作用的药物在与含马兜铃酸中药合用时,是否会影响马兜铃酸的毒性,也值得深入研究。目的采用体外细胞培养系统和整体动物试验系统,研究肝脏微粒体细胞色素P450同工酶对马兜铃酸毒性的影响,以筛选和确定影响马兜铃酸毒性的主要细胞色素P450同工酶,为临床安全用药以及寻找预防马兜铃毒性的方法提供参考。方法第1章:影响马兜铃酸肾小管细胞毒性的细胞色素P450同工酶（CYP450）的体外筛选本实验选择了几种典型的细胞色素P450同工酶抑制剂,主要包括:二乙基二硫代氨基甲酸钠（sodium diethyldithiocarbamate,CYP4502A6和2E1的抑制剂）,奎尼丁（quinidine,CYP4502D6的抑制剂）,α-硫辛酸（α-lipoic acid,NADPH.P450还原酶的抑制剂）,α-萘黄酮（α-naphthoflavone,CYP4501A1和1A2的抑制剂）,磺胺苯吡唑（sulfaphenazole,CYP4502C的抑制剂）,酮康唑（ketoconazole,CYP3A4的抑制剂）。以体外培养的人类肾小管上皮细胞（HK-2）作为检测AA致肾小管毒性的体外模型,用肝脏微粒体混合酶系（S9）加入到HK-2细胞培养中模拟体内代谢环境,将CYP450同工酶的典型抑制剂,分别加入培养体系中,造成不同P450同工酶活性抑制状况,通过细胞增殖抑制率（MTT）试验和LDH释放试验来检测AA单独用药或AA与抑制剂联合用药情况下的细胞毒性。本实验采用5×4×2的析因实验设计,初步筛选影响AA毒性的CYP450亚型。第2章:CYP450 1A2、CYP450 3A4重组酶对马兜铃酸肾小管细胞毒性的影响以前述初步筛选结果为基础,继续在HK-2细胞模型上,进一步验证纯化的细胞色素P450同工酶（CYP1A2,CYP3A4重组酶）对AA肾小管细胞毒性的影响。本实验采用4×4析因实验设计进行体外联合用药,其中AA设3个浓度。CYP1A2或CYP3A4重组蛋白设3个浓度。第3章:不同的细胞色素P450（CYP450）酶诱导剂（苯巴比妥钠、利福平、奥美拉唑）与马兜铃酸联合用药对马兜铃酸致小鼠毒性的影响在体外试验结果的基础上,采用小鼠体内试验,进一步验证并确定影响马兜铃酸毒性的主要细胞色素P450同工酶。本实验选择了几种典型的细胞色素P450同工酶诱导剂—苯巴比妥钠（PB,CYP总酶诱导剂）、利福平（RFP,CYP3A诱导剂）、奥美拉唑（OM,CYP1A诱导剂）。将小鼠随机分为20个试验组,包括:对照组,AA单独用药的4个剂量组(60 mg·kg-1、48 mg·kg-1、38.4 mg·kg-1和30.72mg·kg-1),PB单独用药组,PB+AA4个剂量组,RFP组,RFP+AA4个剂量组,OM组,OM+AA4个剂量组。实验前将动物禁食16 h,自由饮水:预先3天对照组和马兜铃酸组给予0.5%羧甲基纤维素钠10 mL·kg-1,诱导组分别给予诱导剂PB 40 mL·kg-1,RFP 40 mL·kg-1,OM 200 mL·kg-1,第3天禁食;第4天先给予诱导剂,3 h后给予马兜铃酸,给完药后,给食给水。连续观察14天,观察动物一般情况,每2天称1次体重,观察给药组动物的体重变化情况;死亡动物解剖检查,查看各脏器情况,并且记录死亡情况计算LD50;观察期结束后,动物禁食16 h后,称禁食后体重,取血测定CRE、UREA,同时取出小鼠肝、胃、肾,计算脏器指数。结果第1章:影响马兜铃酸肾小管细胞毒性的细胞色素P450同工酶（CYP450）的体外筛选实验结果表明:肝脏微粒体总酶（S9）加入到HK-2培养体系中后,对AA所致的肾小管细胞毒性具有一定程度的降低作用。与AA单独用药组相比,AA+S9组的细胞增殖抑制率降低,LDH释放率变化百分数减少,二者有统计学差异（P＜0.05）。MTT检测和LDH释放试验发现,二乙基二硫代氨基甲酸钠、奎尼丁、α-硫辛酸和磺胺苯吡唑所形成的抑制效应对AA的肾小管细胞毒性可能影响不明显。而酮康唑在无明显细胞毒影响的情况下,与AA+S9组相比,AA+酮康唑+S9组可使AA抑制HK-2细胞增殖的作用明显增强（P＜0.05）,抑制的相对倍数增大,表明酮康唑可能通过抑制CYP4503A4酶活性而对AA的细胞毒性具有增强作用。同时本研究结果也显示,在α-萘黄酮略有些细胞毒影响的情况下,与AA+S9组相比,AA+α-萘黄酮(12.5μg·mL-1)+S9组LDH释放率增高,释放变化的相对倍数增大,二者有显著性差异（P＜0.05）。表明α-萘黄酮可能通过抑制CYP4501A酶活性而影响AA的细胞毒性作用。从而初步筛选得出CYP4503A,CYP4501A是影响AA的代谢活化的主要同工酶。第2章:马兜铃酸与CYP4501A2、CYP4503A4重组蛋白联合对AA肾小管细胞毒性的影响实验结果提示:与同等浓度的单独AA组相比较,AA与重组蛋白CYP3A4联合用药后LDH释放率变化百分数均降低。与同等浓度的单独AA组相比较,AA+CYP1A2(97.5 pmol·mL-1)联合用药时LDH释放率的变化百分数增高,释放相对倍数＞1,而AA+CYP1A2(25 pmol·mL-1)联合用药组LDH释放率的变化百分数降低,释放相对倍数＜1。实验结果表明:CYP3A4和CYP1A2是影响AA致HK-2细胞毒性的主要的CYP450亚型,CYP3A4能降低马兜铃酸对HK-2细胞的毒性,而CYP1A2活性较高时可能增加AA马兜铃酸对HK-2细胞的毒性,活性较低时可能降低AA马兜铃酸对HK-2细胞的毒性。第3章:不同的细胞色素P450（CYP450）酶诱导剂（苯巴比妥钠、利福平、奥美拉唑）与马兜铃酸联合用药对马兜铃酸致小鼠毒性的影响采用Bliss法计算LD50,AA单独组的LD50为55.01 mg·kg-1。经PB诱导的小鼠,再服用AA后其毒性明显降低,可使AA导致的小鼠死亡率降低,死亡时间延迟,表明体内肝脏CYP450总酶的诱导可明显减轻毒性。经RFP诱导后,给小鼠灌胃给予AA,AA的LD50为33.82 mg·kg-1,比AA单独用药的LD50值(55.01 mg·kg-1)降低了约38.5%。结果提示CYP450 3A4的诱导可增强AA毒性。经OM诱导后,给小鼠灌胃给予AA,AA的LD50为56.22 mg·kg-1,与AA单独用药组的LD50值(55.01 mg·kg-1)相差不明显,表明CYP450 1A的诱导对AA毒性无明显影响。结论1.肝脏细胞色素P450（肝脏微粒体）总酶活性增高可以在一定程度上降低马兜铃酸毒性2.不同的细胞色素P450酶亚型对马兜铃酸肾脏毒性的影响有所不同,其中细胞色素P4503A4活性增高可能增强AA的毒性。本研究结果提示:某些具有肝P450酶诱导或抑制作用的药物与含马兜铃酸中药联合用药时可能影响马兜铃酸毒性。故临床联合用药应注意联合用药的安全性。此外,不同个体体内肝脏P450酶活性的差异可能造成对AA敏感性的不同,从而在服用含AA药物后表现出毒性差异。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词表
• 综述
• 前言
• 第1章 影响马兜铃酸肾小管细胞毒性的细胞色素P450同工酶（CYP450）的体外筛选
• 一、肝脏微粒体混合酶（S9）的制备及其对肾小管细胞的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 小结
• 二、马兜铃酸（AA）和酮康唑等6种细胞色素P450（CYP450）同工酶抑制剂对HK-2细胞增殖的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 小结
• 三、酮康唑等6种细胞色素P450（CYP450）同工酶抑制剂 对AA致HK-2细胞的毒性的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 小结
• 第2章 马兜铃酸与CYP450 1A2、CYP450 3A4重组蛋白联合 对AA肾小管细胞毒性的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 实验结果
• 4 小结
• 第3章 不同的细胞色素P450（CYP450）酶诱导剂（苯巴比妥钠、奥美拉唑、利福平）与马兜铃酸联合用药对马兜铃酸致小鼠毒性的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 小结
• 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历