论文摘要
牛精液冷冻技术是繁育改良和育种工作的重要手段,冷冻精液已成为国际贸易的重要商品,而其质量的优劣直接影响到牛的改良以及农民和企业的经济效益。牛冷冻精液在我国发展30多年来,尽管在实际生产中已推广应用,但人们逐渐了解到冷冻融解后的精子即使膜完整且活泼运动,其功能也明显与鲜精不同。对精液稀释、冷冻-解冻等冻精生产工艺的各个环节进行优化组合,以提高精子冻后活力和受胎率;延长冻精冷冻保存和解冻后保存的时间,使之更好的服务于养牛生产,仍是继续努力的方向。为了进一步提高牛精子冷冻解冻后的品质,提高精子抵抗低温打击的能力,本试验以海藻糖、牛血清白蛋白、中药复方和十二烷基磺酸钠作为冷冻保护剂,以冷冻解冻后精子活率、顶体完整率和质膜完整率为评定标准,研究了这几种冷冻保护剂对冻后牛精子质量参数的影响,优化了牛精液冷冻保存稀释液配方。结果表明:1.在冷冻保存液中添加HA能显著提高牛精液冻后活率和质膜完整率（P<0.05）,但顶体完整率与对照组差异不显著（P>0.05）;HA添加水平为0.025 M时,活率和质膜完整率分别为44.83 %和44.83 %,极显著优于其它添加水平及对照组（P<0.01）,但顶体完整率为40.00 %,与对照组相比差异不显著（P>0.05）。在冷冻稀释液中添加BSA能显著提高牛精液冻后活率、顶体完整率和质膜完整率（P<0.05）;BSA添加水平为1g/L时,其精子活率、质膜完整率分别为43.50%、44.80%,和其它添加水平及对照组均存在明显差异（P<0.05）,其顶体完整率为42.44 %,比对照组高2.25 %,但差异不显著（P>0.05）。HA和BSA存在极显著的互作效应（P<0.01）,效果较好的组合为0.00037 M HA和2 g/L BSA,其活率冷冻-解冻后精子活率、顶体完整率和质膜完整率分别为45.50 %、46.29 %（P<0.01）、45.56 %（P<0.05）。2.将三种不同配方的中药提取液分别以6%、12%、24%、48%的体积分数添加于稀释液中,复方一和复方二的效果较好。复方一在稀释液中的添加比例为12 %时,冻后精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别为41.50 %、40.14 %、38.16 %,显著高于对照组（P<0.05）;复方二在稀释液中添加量为6 %时,冻后精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别为41.33 %、41.59 %、40.00 %,显著高于对照组（P<0.05）。复方一和复方二之间差异不显著。3.在牛冷冻精液稀释液中添加十二烷基磺酸钠（SDS）, 0.1 % （w/v）的SDS可显著提高冻后牛精子活率、顶体完整率和质膜完整率,分别为44.16 %、47.94 %、38.33 % （P<0.05）;SDS添加量为0.07 %时,精子顶体完整率最高,达49.05 %,但与0.1 %添加量相比,差异不显著。组随着添加浓度的增加,冻后牛精子质量也随之改善,但到0.2 %添加量时,冻后牛精子质量显著下降（P<0.01）。4.在分别对HA、BSA、中药复方和SDS四种物质最佳添加量筛选的基础上,通过正交试验设计进行综合优化试验,得到优化稀释液配方:Tris 2.42 g、柠檬酸1.34 g、葡萄糖1 g、青链霉素各200,000 IU、卵黄20 ml、甘油12.8 ml、中药复方二提取液6 %、BSA 1g/l、SDS 0.07 %。