机械通气所致急性肺损伤对大鼠昼夜节律改变和肺组织基因表达的影响

论文摘要

背景和目的机械通气肺损伤（ventilation-induced lung injury, VILI）是一种伴有细胞因子释放的广泛肺泡毛细血管膜的损伤,其发生率约占机械通气的5%-39%。VILI的发生涉及到传统的气压伤、容积伤、不张伤,以及生物性损伤。但VILI的发病机制复杂,迄今尚未完全阐明。目前很多报导指出肺肿瘤、慢性肺阻塞性疾病、哮喘等呼吸系统疾病以及缺血缺氧性脑损伤打破机体昼夜节律性而致病,运用时间疗法能有效诊治。VILI作为呼吸系统急性损伤,昼夜节律失衡亦可能是其发病机制之一。另外VILI是全身炎症反应的一部分,或是针对肺组织的特异反应,由多种细胞和因子参与,伴随着多个基因和通路的表达。研究这些基因和通路,对于阐明VILI的发病机理具有重要意义。现已发现了许多这方面的基因,但我们还需要在全基因组的水平上进行检测,以全面研究VILI相关基因的表达。基因芯片（gene chip或DNA microarray）作为一种高通量、高效能的筛选工具,是研究基因表达的有效方法。本研究采用全基因表达谱芯片技术,筛选VILI大鼠差异表达基因,并分析这些基因的功能以及是否与昼夜节律相关基因关联,以进一步探讨VILI发病的分子机制。材料和方法1 VILI模型的制备以及昼夜节律变化的探讨72只SD大鼠,适应性饲养（12h-day/12h-night）2周,将大鼠按照预进行通气处理的四个时间点（1AM,7AM,1PM,7PM）随机分为四个组,每组18只,每个时间点再随机分为三组（FB组n=6、LV组n=6、HV组n=6）:FB组,自由呼吸组,不予机械通气干预;LV组,保护性机械通气组,给予Vt 8ml/Kg,PEEP 0mmHg;HV组,大潮气量通气组,给与Vt 40ml/Kg,PEEP 0mmHg。共维持3h。监测每只大鼠的平均动脉压、心率、血气变化。3h后放血处死大鼠,并留取标本。HE染色观察大鼠肺组织,并运用液相芯片技术检测血浆促肾上腺皮质激素（ACTH）、褪黑素（MT）水平。2基因芯片技术筛选大鼠VILI差异表达基因选取1AM、1PM时间段FB组及HV组雄性大鼠,每组大鼠的不同时间段肺组织提取RNA,等量混合,采用Affymetrix公司的Rat Genome 230 2.0 Array,检测大鼠的基因表达谱。在基因芯片结果中,选取Cyp1a1、Npas2、Nr1d1 3个差异基因,并对72只大鼠行RT-PCR,检验表达谱芯片的准确性,并进一步探讨VILI的分子机制。3统计分析实验结果以均数±标准差（（x|-）±s）表示。基因芯片统计分析参照Affymetrix文件。其余统计分析应用统计软件SAS 9.1进行统计分析,P<0.05表示差异有统计学意义,P<0.01表示差异有显著统计学意义。定量资料经正态和方差齐性检验后,组间比较采用单因素方差分析（One Way ANOVA）,多因素方差分析,组内两两比较采用Tukey法进行。利用余弦节律函数F（t）=M+A cos（ωt+Φ）构建模型并进行节律分析,P<0.05,说明模型拟合,节律存在且具有统计学意义。Mesor代表余弦模型中的M值,Amplitude代表A值,通过A/M值判定,比值越高,说明节律性越强。结果1.动脉血压、心率、MT组间差异无统计学意义,余弦分析无节律性,P>0.05。ACTH组间比较差异具有统计学意义,P<0.01。2.动脉血气变化,实验前3组大鼠动脉血pH值、PaCO2和PaO2的差异无统计学意义,P>0.05;3h通气处理后,HV组的PaCO2明显降低,P<0.05。3.肺损伤评分,与FB组、LV组比较,HV组的肺损伤评分具有显著的差异,P<0.01。4.基因芯片检查差异表达基因:HV组与FB组比较,共同差异基因56个,其中上调43个,下调13个。Il-6、Cox-2、Ccl2基因表达上调。对差异基因进行功能分类有以下几种:a.炎症相关基因,b.代谢相关基因,c.免疫相关基因,d.信号转导相关基因,e.其它如氧化抗氧化基因等。5. RT-PCR检测Cyp1a1、Npas2、Nr1d1基因,与基因芯片表达趋势相同。相对于FB组及LV组,HV组Nr1d1基因表达显著下降,p<0.05。余弦分析Nr1d1基因在FB组具有节律性,P<0.05,余未见明显节律性。结论1.本文成功地建立机械通气肺损伤的大鼠在体模型（VILI）,探讨了机械通气相关性肺损伤的病理生理改变及其可能原因与机制,为后续研究提供依据。2.血浆ACTH水平在机械通气中存在组间差异,本次实验未见MT、ACTH存在节律性。3. VILI的分子机制极为复杂,是多基因协同作用的结果,涉及到信号通路、氧化应激反应、代谢途径、免疫反应等多种改变。4. VILI的发生包括多条信号通路,其中释放细胞因子Il-6及各种趋化因子是其共同通路。5. Nr1d1表达下降可导致Il-6、Cox-2表达增加,诱导NF-kB的过度活化,从而致急性肺损伤。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词
• 背景与目的
• 1 VILI 研究进展
• 2 昼夜节律研究进展
• 3 研究目的
• 第1章 VILI 模型的制备以及昼夜节变化的探讨
• 1.1 前言
• 1.2 材料和方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 1.5 结论
• 第2章 基因芯片技术筛选VILI 大鼠差异基因以及RT-PCR 验证筛选基因
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 结论
• 参考文献
• 综述：机械通气肺损伤研究进展
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历