黄瓜芽黄突变相关基因CLpP的克隆及其功能分析

论文摘要

目的：（1）以正常黄瓜（Cucumis sativus L.）（新泰密刺）和芽黄突变体黄瓜（新泰密刺）为研究对象,筛选正常与芽黄突变体黄瓜中的ClpP基因,分析其核酸序列并预测相关蛋白的结构和功能。为后期研究芽黄相关基因ClpP的作用机制提供目标序列和研究基础。（2）构建芽黄相关基因ClpP的植物表达载体,并进行该基因对烟草的遗传转化,通过生理性状分析该基因功能。方法：（1）分别提取正常黄瓜和芽黄突变体黄瓜不同生长时期叶片的总RNA,反转录合成cDNA,采用特异性引物PCR扩增得到芽黄相关基因ClpP的cDNA序列核心序列,连接到pGEM-T载体后测序,测序结果经Blaxtn和GenBank公共数据库进行比对分析。（2）含目的片段的pGEM-T载体和农杆菌EhA105经双酶切后分别获得目的条带和表达载体,用连接酶连接获得重组子后经电击转化转入农杆菌并用该农杆菌侵染烟草愈伤组织。愈伤组织诱导分化发芽后,观察其生理性状分析其功能。结果：（1）经测序后得到正常黄瓜和芽黄突变体ClpP基因序列为494bp。可编码164个氨基酸。从1到132氨基酸之间有S14ClpP2保守结构域,没有信号肽,推测其可能不是分泌蛋白。与预测的黄瓜叶绿体合成全基因组比对发现,该基因有三个外显子,二个内含子组成,但本研究只获得了两个外显子序列。将该基因氨基酸序列与其他七种植物的氨基酸序列进行比对,并进行系统进化分析,发现黄瓜最先和毛茛属植物（Ranunculus macranthus）聚类,再和拟南芥1（Arabidopsis thaliana）聚类。（2）携带正常和芽黄黄瓜的ClpP基因的农杆菌介导遗传转化获得的烟草均未出现明显的芽黄现象。结论：（1）正常黄瓜与芽黄突变体的ClpP基因序列与结构完全相同,他们含有相同的高度保守的结构域S14ClpP2,在黄瓜芽黄现象中该基因可能在调控水平发挥作用。（2）携带正常和芽黄黄瓜的ClpP基因农杆菌介导遗传转化试验中未获得出现芽黄现象的烟草植株,这种现象可能有以下几种原因引起：1.黄瓜的ClpP基因在烟草中未能成功表达；2.ClpP基因编码的蛋白在黄瓜中可能只在调控或信号转导水平发挥作用,但由于黄瓜和烟草属不同种属植物,因此该功能在烟草中可能未能正常发挥作用；3.黄瓜的ClpP基因可能与黄瓜的芽黄表现型无关,具体原因需进一步试验研究。ClpP基因的相关功能需在后期做进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写词表
• 目录
• 前言
• 1 文献综述
• 1.1 植物叶色突变体相关研究
• 1.1.1 植物叶色突变的来源
• 1.1.2 植物叶色突变的种类
• 1.1.3 植物叶色突变发生机制研究
• 1.1.4 植物叶色突变的应用
• 1.2 Clp蛋白酶相关研究
• 1.2.1 各种生物的Clp蛋白酶
• 1.2.2 Clp蛋白酶全酶结构和作用机制
• 1.2.3 蛋白功能
• 1.3 本试验的研究内容、试验目的和研究意义
• 1.3.1 研究内容
• 1.3.2 实验目的与意义
• 2 芽黄突变相关基因ClpP的克隆及其植物表达载体构建
• 2.1 芽黄突变相关基因ClpP的克隆
• 2.1.1 试验材料及主要试剂
• 2.1.2 试验方法
• 2.1.3 结果与分析
• 2.2 ClpP基因植物表达载体构建
• 2.2.1 试验材料及主要试剂
• 2.2.2 试验方法
• 2.2.3. 结果与分析
• 3 农杆菌介导的ClpP基因对烟草的遗传转化
• 3.1 农杆菌介导的ClpP基因对烟草的遗传转化
• 3.1.1 主要材料及主要试剂
• 3.1.2 试验方法
• 3.1.3 结果与分析
• 4 总结与展望
• 4.1 总结
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 导师评阅表