烟草γ-tubulin基因沉默的效应分析

论文摘要

γ-微管蛋白基因是自然界最保守的基因之一,其编码蛋白是微管组织中心（microtubulin organization center,MTOC）的重要组成成分。人们最早在动物上的研究表明,γ-微管蛋白作为动物中心体的一种重要成分,在微管的成核、细胞周期调控以及有丝分裂纺锤体的形成等方面起非常重要的作用。由于植物细胞中没有中心体的结构,它在植物细胞中的功能一直没有非常明确的答案,这也成为近年来很多植物细胞生物学家关心的热点问题。鉴于γ-tubulin基因是一种非常重要的保守基因,它的断裂可引起生物致死,因此应用传统方法研究其功能很困难。最近国内外学者利用负向遗传学的手段进行了大量的研究,Pavla和Martine分别利用诱导型的RNA干涉的方法及通过筛选得到γ-tubulin基因的突变体的方法研究了该基因对拟南芥植株生长发育的影响,发现γ-tubulin低表达可影响到叶片的生长、根的发育及气孔的排布等。本研究组也利用PVX诱导的γ-tubulin基因沉默的方法,首次得到了γ-tubulin基因低表达的烟草植株,发现该基因的低表达对植株的生长发育有明显的影响,如叶片形状变窄、长宽比明显增大、叶片部分区域出现明显的皱褶或卷曲,在生殖生长阶段甚至出现全部花苞脱落等特殊表型。本研究首先以烟草（N.tobacum var.Samsun NN）无菌苗为材料,通过农杆菌介导的转基因技术,将携带有部分正反串连的γ-tubulin基因片段的载体转化到烟草无菌苗中,利用得到的γ-tubulin基因低表达的烟草转化体的表型来进一步分析该基因对植物生长发育的影响。结果表明,γ-tubulin低表达对植株的生长发育产生了明显的影响:有80%左右的植株出现了多个生长点;而且叶片形态出现异常,有大量的联体叶或筒状叶出现;另外植株根的形态也发生改变,主要表现为主根不发达而侧根呈强势生长的“鱼刺状”。对植株生长素IAA的分析测定发现,γ-tubulin低表达植株其内源生长素IAA含量明显高于对照空载植株,通过进一步对其极性运输输出载体基因P-glycoproteins（PGP1）的表达分析发现,PGP1在γ-tubulin低表达植株上部的表达量明显低于对照空载植株。因此推测,γ-tubulin低表达对植株生长发育的影响可能与生长素合成异常及其极性运输受到抑制有关,从而最终使植物生长发育产生异常。另外,本研究还分析了含有γ-tubulin部分插入片段（从319核苷酸至841核苷酸的522 bp的编码区片段）的重组PVX载体（PVX:as Gam D）侵染的烟草植株的花药发育情况。研究发现,当植株花苞发育到一定时期时,出现所有花苞陆续脱落的现象。利用Real time PCR检测花苞基部γ-tubulin的表达,发现被PVX:asGamD侵染的烟草中γ-tubulin mRNA水平明显降低,这表明在这些植株中发生了γ-tubulin的基因沉默。应用石蜡切片法分别对对照植株（PVX空载体侵染的植株）花苞和γ-tubulin基因沉默的植株花苞进行观察,结果表明:野生型烟草中小孢子发生和雄配子体发育过程正常,有雄蕊5枚,雄蕊原基经过一系列分化后发育形成4个小孢子囊,造孢细胞进一步分化形成排列紧密的小孢子母细胞,小孢子母细胞经减数分裂最终形成四分体;经正对照PVX空载体侵染的烟草,其小孢子发生和雄配子体发育过程无异常;γ-tubulin基因沉默的烟草小孢子发生和雄配子体发育出现明显的异常现象:有的花苞在造孢细胞时期发育正常,随着小孢子进一步发育到小孢子母细胞时期时出现了异常,发生早脱;有的花苞在四分体时期绒毡层细胞和小孢子发生了畸变导致脱落;同时在此过程中还观察到胚珠发育也表现异常。因此γ-tubulin基因沉默严重影响了烟草小孢子发生及雄配子体发育。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 名词缩写
• 第一部分 文献综述
• 1 RNA沉默的发现
• 2 RNA沉默的作用机制
• 3 几种可能的沉默信号分子
• 3.1 siRNA
• 3.2 miRNA
• 4 信号分子的移动规律
• 4.1 韧皮部蛋白协助运输沉默信号
• 4.2 RdRP协助放大沉默信号
• 5 RNAi在植物研究中的应用
• 5.1 RNAi在植物基因功能研究中的应用
• 5.2 RNA沉默的两种常用技术方法及应用
• 6 γ-微管蛋白的结构与功能
• 6.1 γ-微管蛋白的结构
• 6.2 γ-微管蛋白的功能
• 本题的理论及实际意义
• 本实验技术路线
• 第二部分 农杆菌介导法研究烟草γ-微管蛋白基因沉默效应
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 烟草总RNA的提取和γ-tubulin部分cDNA片段的克隆
• 1.2.2 dsRNA载体的构建及转化
• 1.2.3 叶盘法转化烟草
• 1.2.3.1 农杆菌培养
• 1.2.3.2 侵染
• 1.2.3.3 共培养
• 1.2.3.4 选择培养
• 1.2.3.5 生根培养
• 1.2.4 转基因烟草的PCR鉴定
• 1.2.4.1 转基因烟草总DNA的提取
• 1.2.4.2 PCR鉴定转基因烟草
• 1.2.5 转基因烟草的RT-PCR检测
• 1.2.5.1 Trizol法提取植物总RNA
• 1.2.5.2 RT-PCR鉴定
• 1.2.6 斑点杂交鉴定转基因烟草
• 1.2.6.1 探针的制备
• 1.2.6.2 斑点杂交
• 1.2.7 石蜡切片法观察根的细胞形态
• 1.2.8 Western检测转基因植株中γ-tubulin、α-tubulin蛋白表达量变化
• 1.2.8.1 烟草植株可溶性总蛋白的提取
• 1.2.8.2 SDS-PAGE电泳
• 1.2.8.3 转膜
• 1.2.8.4 Western Blot
• 1.2.9 HPLC法检测组织中内源IAA的含量
• 1.2.9.1 烟草叶片内源生长素的提取
• 1.2.9.2 烟草内源PGP1的扩增
• 2 实验结果
• 2.1 γ-tubulin cDNA的克隆
• 2.2 含γ-tubulin部分cDNA片段的dsRNA载体构建成功
• 2.3 叶盘法转基因烟草
• 2.4 转基因烟草植株的筛选和鉴定
• 2.5 RT-PCR检测转基因烟草中γ-tubulin转录水平的动态变化
• 2.6 斑点杂交
• 2.7 Western blot检测转基因烟草中γ-tubulin表达水平的变化
• 2.8 植株表型出现异常
• 2.8.1 根尖发育异常
• 2.8.2 地上部发育异常
• 2.9 内源IAA含量及生长素极性运输载体PGP1基因的表达的变化
• 3 讨论
• 3.1 γ-tubulin对植株生长发育的影响可能与对整个微管系统的破坏有关
• 3.2 γ-tubulin的变化对植物生长发育的影响
• 3.3 γ-tubulin基因沉默可能影响生长素的含量或极性运输
• 第三部分 γ-tubulin基因沉默对小孢子发生及雄配子体发育的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 野生型和正对照烟草花苞的发育过程正常
• 2.1.1 造孢时期
• 2.1.2 小孢子母细胞时期
• 2.1.3 四分体时期
• 2.1.4 小孢子释放期
• 2.1.5 小孢子成熟期
• 2.2 经含γ-tubulin D片段的重组PVX载体侵染的烟草花苞发育异常
• 2.3 经含γ-tubulin D片段的重组PVX载体侵染的烟草顶端γ-tubulin表达水平下降
• 3 讨论
• 3.1 γ-tubulin基因沉默导致小孢子发育过程异常
• 3.2 γ-tubulin基因沉默可导致花药、花丝、花冠下端萎缩
• 3.3 γ-tubulin基因沉默影响到雌配子体的形成
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 硕士研究生期间发表的论文
• 致谢