携带抗P-选择素单抗靶向微泡行对比超声评价肾缺血再灌注损伤的实验研究

论文摘要

背景和目的靶向分子显像研究是目前国际上影像学技术领域正在探讨的前沿热点,经典的靶向分子显像技术主要有核素影像及核磁共振成像（MRI）技术。然而,具有空间和时间分辨率高、适应面广、价格便宜、可重复使用和无放射污染等优点超声影像在靶向分子显像研究上却远远落后于其它影像学技术。近年来,随着靶向超声微泡造影剂的出现,靶向超声分子显像（targeted ultrasoundmolecular imaging）逐渐成为现实,极大的拓展了传统超声微泡的应用范围,使应用超声技术从分子水平对各种疾病进行早期诊断成为可能,被誉为超声医学发展史上的“第三次革命”,具有极大的研究和应用价值,势必会在分子影像学中发挥非常重要的作用。血管内皮损伤/炎症普遍存在于冠心病、高血压和糖尿病等危害人类健康和生命的重要疾病之中,与它们的发生、发展及预后密切相关。血管内皮损伤/炎症时,血管内皮细胞P-选择素表达明显上调,介导血小板和中性粒细胞的募集、外渗,后者被激活并释放大量前炎症介质和趋化因子,在加重损伤和炎症反应方面起重要作用。因此,如能成功构建外壳携带有抗P-选择素单抗的靶向超声微泡,并行对比超声检查获得“P-选择素”的靶向超声分子图像,则可望无创性的早期评价组织和器官的血管内皮损伤/炎症,这无疑将具有十分重要的临床意义。近几年,运用靶向超声分子显像技术评价微血管炎症或相关的血管内皮反应已日益成为国内外超声领域的研究热点,具有广阔的应用前景和重要的临床意义。但目前相关研究在国际上尚处于试验研究的起步阶段,存在诸多问题亟待解决;而国内尚未见有应用高效价靶向微泡评价微血管炎症或相关的血管内皮反应的报道,相关研究基本还没有实质性进展。肾脏作为机体的主要高灌注器官之一,对缺血再灌注（ischemia- reperfusion,IR）十分敏感。肾缺血再灌注损伤（ischemia- reperfusion injury,IRI）是临床上颇为多见的重要病理生理现象,常见于低血容量性休克、肾脏移植等情况。有研究表明,IRI是缺血性肾功能衰竭的主要损伤环节,也是肾移植手术后影响移植肾早期功能恢复及远期存活时间的重要因素。肾IR时,血管内皮细胞表达P-选择素增加,促进血小板和中性粒细胞沿血管内皮滚动、黏附、聚集和外渗,后者可介导血管内皮炎症反应并释放多种炎症介质和促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-a（TNF-a）、白细胞介素-1（IL-1）、血栓素A2（TXA2）等,进而导致肾微血管及细胞损伤,是造成肾IRI的重要原因。目前,临床上尚无有效评价肾IRI血管内皮损伤/炎症的无创性检测手段,若能构建针对肾IRI时血管内皮炎症相关因子（P-选择素）的靶向超声微泡,并行对比超声实现靶向超声分子显影对肾IRI作出早期的有效评价或诊断,无疑对临床早期防治IRI具有积极意义。因此,本研究在普通脂质微泡的基础上,通过“抗生物素蛋白/生物素复合体”（avidin-biotin）的化学桥接作用（bridging chemistry）将抗小鼠P-选择素单克隆抗体连接于脂质微泡外壳构建了携带抗P-选择素单抗靶向微泡（MBp）,并在肾缺血再灌注损伤及肾假手术小鼠模型上,应用MBp和普通脂质微泡（无携带抗P-选择素单抗的脂质微泡,MB）行对比超声检查,目的在于探讨MBp结合CEU评价小鼠肾缺血再灌注血管内皮损伤的可行性。材料和方法1、超声微泡的制备:各种脂质材料按一定比例75℃水浴溶解于适量蒸馏水中,同时通全氟丙烷（C3F8）气体,超声振荡至形成乳白色液体制备普通脂质微泡（MB）或生物素（Biotin）化脂质微泡。生物素化脂质微泡经静置弃下清液并加入等量蒸馏水去除未结合脂质纯化4次后,按一定比例加入抗生蛋白链菌素/亲和素（streptavidin）。继续静置弃下清液并加入等量蒸馏水去除未结合抗生蛋白链菌素纯化微泡2次后得到外壳结合有抗生蛋白链菌素的脂质微泡,再按一定比例加入生物素化的抗小鼠P-选择素单抗（biotin conjugated ratanti-mouse P-selectin monoclone antibody）得到携带抗P-选择素单抗靶向微泡（MBp）,最后静置弃下清液并加入等量蒸馏水去除未结合抗体纯化MBp2次。MB及MBp均于冰箱中4℃保存备用。采用库尔特计数仪测量MB及MBp的平均粒径及浓度。2、MBp的体外鉴定:采用绿色荧光标记的二抗与抗P-选择素单抗结合,荧光显微镜下观察抗P-选择素单抗与微泡的连接情况。采用平行板流动腔技术在体外模拟的生理血流条件下评价MBp与小鼠P-选择素Fc段(RecombinantMouse P-Selectin/Fc Chimera,PSFc)的靶向黏附效能。3、动物模型的制备:16只小鼠随机分为2组:假手术组（SH组,6只）及肾缺血再灌注组（IR组,10只）。所有实验小鼠经常规麻醉后,尾静脉插留置针用于注射微泡,背部备皮后随机取一侧行约1.2cm纵行切口,游离肾脏,IR组小鼠行无损伤动脉夹夹闭肾蒂,造成肾缺血达30min后释放动脉夹再灌注1h:SH组小鼠只作一侧肾脏游离,不作肾蒂夹闭。4、肾CEU检查及图像分析:对所有实验小鼠行MB和MBp的肾对比超声检查。动物模型制备后,将处理肾回纳小鼠体内并置自制水囊于小鼠肾脏之上,用自制支架固定超声探头（17L5）于水囊上,调整探头位置获得良好肾脏图像后保持探头位置在整个实验过程中不变,仪器的各项参数在整个实验过程中保持不变。CEU采用经尾静脉微泡弹丸式注射法进行,每只实验小鼠采用微量进样器经尾静脉随机（间隔30min）注射MB和MBp的数量均为约4×106个。经过10min循环时间待血池中循环微泡消失后对实验小鼠进行肾CEU检查,获仁笛樾∈笕毖俟嘧⑸龊图偈质跎龅南杂巴枷瘛EU检查采用二次谐波成像（second harmonic imaging）技术进行,探头发射和接收频率分别为7.0和14MHz,机械指数（Mechanical Index,MI）为0.18,超声发射间隔（PulsingInterval,PI）时间设定为10s,获取第一帧CEU图像（代表MB及MBp在肾组织中的滞留浓度）后给予高MI（1.9）连续超声发射2～3s以破坏微泡,继续存储本底图像4～5帧,全部声学造影图像存于MO盘,以备脱机分析。采用MCE软件分析CEU图像,测量实验小鼠缺血再灌注肾和假手术肾超声显影的声强度（video intensity,Ⅵ）数值并制作彩色编码图。5、病理学检查和免疫组化检查:完成CEU图像采集后,取出实验小鼠肾脏,10%甲醛固定,行病理学检查及免疫组化检查。结果1、微泡制备情况:采用库尔特计数仪测得MB平均粒径为2.83um,浓度约为1.5×109个/毫升;MBp平均粒径2.73um,浓度约为7.1×108个/毫升。2、MBp体外鉴定情况:采用绿色荧光标记的二抗与抗P-选择素单抗结合,荧光显微镜下观察显示MBp外壳显明显绿色荧光,表明抗P-选择素单抗与微泡外壳连接效果良好。平行板流动腔体外评价结果显示,在模拟微血管生理血流条件的剪切应力（＜1.0dyn/cm2）下MBp可与包被于平行板流动腔的PSFc有效结合,显示了很好的主动性靶向黏附效能。3、肾CEU检查结果:MBp的第一帧CEU图像显示IR组缺血再灌注肾可见显著的超声显影,而SH组假手术肾无明显的超声显影;MB的第一帧CEU图像在IR组缺血再灌注肾可见轻度的超声显影,其显影强度较MBp的IR组缺血再灌注肾明显减弱,而MB的第一帧CEU图像在SH组假手术肾中无明显的超声显影。4、CEU图像分析结果:Ⅵ值在SH组-MBp及SH组-MB分别为2.93±1.33和2.73±1.29,两者之间无明显差异（P=0.797）。与SH组相比,IR组-MBp和IR组-MB的Ⅵ值呈显著和轻度的增大（P=0.000）,分别为30.99±9.83和9.87±3.68。IR组-MBp的Ⅵ值是SH组-MBp的10.58倍,而IR组-MB的Ⅵ值仅是SH组-MB的3.62倍。IR组-MB的Ⅵ平均值仅为IR组-MBp的31.8%（P=0.001）。5、肾组织病理学检查及免疫组化检查结果:HE切片结果显示,SH组假手术肾组织肾小管排列整齐,形态正常,间质无充血、水肿;IR组缺血再灌注肾组织可见肾小管上皮细胞肿胀、变性,内可见管型和坏死脱落细胞,伴肾间质水肿及中性粒细胞增多;免疫组化结果显示,IR组缺血再灌注肾组织血管内皮P-选择素表达明显增加,而SH组假手术肾组织血管内皮无明显的P-选择素表达。结论1、应用携带抗P-选择素单抗靶向微泡（MBp）行CEU检查产生“主动性靶向超声分子显像”可有效评价小鼠肾缺血再灌注损伤,将可用于评价微血管炎症或相关的血管内皮反应;2、采用“抗生物素蛋白/生物素复合体”可实现抗P-选择素单抗与脂质微泡外壳的有效连接而成功构建携带抗P-选择素单抗靶向微泡;3、缺血再灌注肾组织血管内皮P-选择素表达增加,炎症反应明显。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 附录一 缩略词表
• 附录二 成果
• 附录三 课题资助基金
• 附录四 论文获奖情况
• 致谢
• 研究生毕业论文统计学审稿合格证明