猪呼肠孤病毒SC-A株的分离鉴定及全基因组cDNA文库的构建和分子遗传特征分析

论文摘要

哺乳动物呼肠孤病毒，通常又直接称作呼肠孤病毒（Reovirus），隶属于正呼肠孤病毒属（Orthoreovirus）成员，主要感染人和哺乳动物，如猪、牛、犬、马、猫、鼠等动物的呼吸道或消化道，具有广泛的致病性。虽然目前对呼肠孤病毒与人类疾病的确切关系尚无定论，但早在1967年Tillotson等就曾报道呼肠孤病毒可导致人类致死性间质性肺炎的发生，且在对SARS病原的相关研究中发现SARS的发生可能与呼肠孤病毒的同时感染有关。目前已报道的猪呼肠孤病毒共3种血清型，在猪群中广泛存在，对猪具有一定的致病性。研究表明用人呼肠孤1型病毒感染仔猪后能从仔猪粪样中再次检测到病毒，同时还可引起仔猪体温的瞬间升高且具传染性，提示应该谨慎对待呼肠孤病毒，特别是应对呼肠孤病毒与动物和人类疾病的关系作进一步研究。本文在国内首次成功地从仔猪腹泻粪样中，分离并鉴定了一株猪呼肠孤病毒，并命名为猪呼肠孤病毒SC-A株（PReoV SC-A）。经反复试验后，最终确定的胰酶在病毒培养液中的最佳工作浓度为5μg／mL。PReoV SC-A在Vero细胞上连续传代，增殖稳定，并表现出以细胞内颗粒增多、细胞肿胀及漂落为特征的CPE。病毒粒子在感染细胞胞浆内呈典型的晶格状排列，并在细胞核周围形成大小不等、无定形的病毒包涵体；包涵体中含有致密核心的成熟病毒粒子（实心）和有透明核心的不完全装配的病毒粒子（空心），以及少量平行排列的特征性的微管样结构。负染可见病毒粒子为无囊膜的球形颗粒，表面分布有大量似放射状排列的壳粒。与其它哺乳动物呼肠孤病毒一样，PReoV SC-A也能在如Vero、ST、MDBK、BHK21等多种传代细胞上增殖，其中Vero传代细胞为分离或增殖呼肠孤病毒最常选用的细胞；除Vero细胞外，与MDBK及BHK21相比，ST细胞则更适合用于PReoVSC-A的增殖传代。形态发生学观察结果表明，PReoV SC-A最早的转录翻译与组装发生在接毒后的4h内，而病毒包涵体的最早形成时间为接毒后的4～6h；在接毒8～10h后，即可在细胞外见到可能通过细胞裂解方式而被释放的病毒粒子。同时，在感染细胞中，还可见有细胞核固缩、呈不规则分叶状，染色质浓缩、边集，但细胞轮廓尚保存完好的细胞凋亡的早期或中期特征。对于在接毒后2～8h内，糖原颗粒在胞浆中的大量聚集现象，推测其可能是为病毒的转录复制提供必要的能量。目前，关于猪呼肠孤病毒的研究报道极少，更无关于病毒基因组信息的报道。为揭示猪呼肠孤病毒基因组的分子生物学特征，有必要进行该病毒基因组cDNA文库的构建。本文根据呼肠孤病毒基因组特有的末端保守序列特征和琼脂糖凝胶电泳特性，探索出了一条以经琼脂糖凝胶电泳回收的dsRNA或混合总RNA为模板，以特异性引物或与随机引物相结合，应用RT-PCR技术，快速扩增出全长cDNA的呼肠孤病毒全基因组cDNA文库构建策略。应用该策略，本文成功扩增并克隆了PReoVSC-A各基因组节段的全长cDNA，并由此构建了含10个重组质粒的PReoV SC-A全基因组cDNA文库。病毒全基因组的测序结果表明，PReoV SC-A基因组全长23.539Kb，其中L1基因组大小为3854bp、L2大小为3915bp、L3为3901bp、M1为2304bp、M2为2203bp、M3为2241bp、S1为1416 bp、S2为1311 bp、S3为1198 bp、S4为1196 bp。在GenBank中的登录号分别为L1 DQ997719，L2 DQ885990，L3DQ403254，M1 DQ396804，M2 DQ482462，M3 DQ403254，S1 DQ396805，S2DQ411553，S3 DQ396806，S4 DQ911244。PReoV SC-A的基因组序列分析表明，PReoV SC-A各基组因节段在分子进化上是彼此独立的，除决定病毒血清型的S1基因组节段外，其余节段都相对保守。PReoVSC-A与各标准株（T1L、T2J、T3D）在S1基因组节段上的差异极大，其氨基酸序列相似性分别为21.1％、22.4％和91.2％。基于S1基因组节段的推导氨基酸序列绘制的分子进化树，支持相同血清型的病毒株位于同一进化分支中。据此，本文将PReoVSC-A的血清型鉴定为血清3型。PReoV SC-A各基因组节段除具有相同的末端保守序列5’-GCTA……TCATC-3’外，在5’和3’末端保守序列附近还存在一对倒转重复序列。PReoV SC-A仅在Leu、Arg、Ser以及终止密码子（从不用TAG）上表现出明显密码子偏爱性，真核表达系统尤其酵母系统更适合PReoV SC-A基因的体外表达。推导蛋白的预测结果表明：PReoV SC-A各编码蛋白均为亲水性蛋白，无跨膜螺旋结构和信号肽序列；除σ1S蛋白为全α蛋白外，其余均为混合型蛋白；非结构蛋白的二级结构中以α螺旋为主，且明显高于结构蛋白；除都具自身蛋白家族的保守结构域外，还预测到一些可能具有特殊功能的结构域，如cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点、σ1中的亮氨酸拉链基序、σ3蛋白和λ1蛋白中的C2H2型锌指基序等。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1 引言
• 2 呼肠孤病毒概述
• 3 呼肠孤病毒的相关性疾病
• 4 呼肠孤病毒的致病机制
• 5 呼肠孤病毒的抗肿瘤作用
• 6 呼肠孤病毒的反向遗传学研究
• 7 生物信息学及在病毒学研究中的应用
• 8 小结
• 第二章 猪呼肠孤病毒SC-A株的分离与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料和主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.3 病毒的鉴定
• 1.4 RT-PCR扩增
• 2 结果
• 2.1 病毒分离与传代
• 2.2 病毒滴度测定结果
• 2.3 病毒核酸鉴定结果
• 2.4 病毒理化试验结果
• 2.5 动物实验结果
• 2.6 电镜下病毒的形态观察
• 2.7 RT-PCR扩增
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 猪呼肠孤病毒SC-A株的细胞适应性试验及形态发生学观察
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料和主要仪器
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 猪呼肠孤病毒（SC-A）在不同细胞上的适应性
• 2.2 猪呼肠孤病毒（SC-A）在Vero细胞上的形态发生学特征
• 3 讨论
• 3.1 猪呼肠孤病毒（SC-A）的细胞适应性
• 3.2 猪呼肠孤病毒（SC-A）的形态发生学特征
• 4 小结
• 第四章 猪呼肠孤病毒SC-A株全基因组cDNA文库的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料和主要仪器设备
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 引物设计
• 2.2 病毒dsRNA的提取及琼脂糖凝胶电泳与回收
• 2.3 病毒cDNA文库的构建
• 3 讨论
• 3.1 猪呼肠孤病毒基因组的琼脂糖凝胶电泳与dsRNA的回收纯化
• 3.2 猪呼肠孤病毒全基因组cDNA克隆策略的探讨
• 4 小结
• 第五章 猪呼肠孤病毒SC-A株全基因组分子遗传特征分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 PReoV SC-A基因组的核苷酸序列分析
• 2.2 PReoV SC-A基因组的系统进化树分析
• 2.3 PReoV SC-A的密码子偏爱性分析
• 2.4 PReoV SC-A的推导氨基酸序列分析
• 3 讨论
• 3.1 关于PReoV SC-A基因组的末端序列特征
• 3.2 关于PReoV SC-A血清型鉴定方法
• 3.3 关于PReoV SC-A基因组序列特征分析
• 4 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文目录