论文题目: 苏云金芽孢杆菌WB9的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 农药学
作者: 黄志鹏
导师: 关雄
关键词: 苏云金芽孢杆菌,分离,生理生化特性,活性因子,克隆和表达,培养基优化
文献来源: 福建农林大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本文对土壤中分离的苏云金芽孢杆菌WB9菌株的生理生化特性、小菜蛾和甜菜夜蛾的致病力测定、编码活性因子的基因分析、杀虫蛋白基因的克隆和表达、工业培养基的室内摇瓶优化筛选以及茶尺蠖的室内外防治试验等进行了较为系统深入的研究。 采用醋酸钠法加热处理和抗生素的分离方法,对收集自武夷山自然保护区非耕作区的200个土壤样品进行了分离,得到12株苏云金芽孢杆菌菌株,出菌率为6.0%。对WB9菌株的室内致病力测定结果表明其对小菜蛾具有高致病力、对甜菜夜蛾具有较高的致病力。 以库斯塔克亚种的8010和8311菌株以及鲇泽亚种的No.1菌株为对照,对新分离的WB5、WB7和WB9菌株的12项经典生理生化指标进行了测定。测定结果显示WB9和WB5分别与库斯塔克亚种8010和鲇泽亚种No.1的生理生化反应特性表现相同,仅在个别反应上有强弱差异。由此推测,WB9和WB5可能分属库斯塔克亚种和鲇泽亚种。 采用PCR及PCR-RFLP技术对WB9的ICP、VIP、几丁质酶和肠毒素4种活性因子的编码基因进行了分析。结果表明:该菌株含有编码ICP蛋白的cry1Aa、cry1Ab、cry1Cb、cry1Fa和cry1Ga 5个cry1基因型,编码Vip3A蛋白的vip3A基因以及编码3种肠毒素的hblA、bceT和entS基因,不含编码几丁质酶的基因。将vip3A、hblA、bceT和entS基因的PCR产物回收纯化后直接测序,利用在线的Blast软件进行同源性分析,前两个基因片段的核苷酸序列与苏云金芽孢杆菌已公布基因序列的相应片段同源性分别为99%和96-98%,bceT基因片段与蜡质芽孢杆菌已公布基因序列的相应片段同源性为97%,entS基因片段与苏云金芽孢杆菌和蜡质芽孢杆菌已公布基因序列的相应片段同源性为94-99%。 设计可扩增出cry1Ab基因完整的开放阅读框(ORF)的引物对F1和R1,通过PCR技术从WB9中扩增出全长的cry1Ab基因。利用高效克隆PCR产物的专
论文目录:
中文摘要
英文摘要
1 前言
1.1 苏云金芽孢杆菌概述
1.2 苏云金芽孢杆菌的活性因子
1.3 ICP蛋白及其编码基因的分类
1.4 编码ICP蛋白的cry基因的鉴定
1.5 ICP蛋白的结构与功能
1.6 ICP蛋白的作用机制
1.7 工程菌和工程植株
1.8 昆虫的抗性及其管理
1.9 本研究的立题依据
2 苏云金芽孢杆菌的分离
2.1 材料与方法
2.1.1 土样的采集
2.1.2 培养基
2.1.3 分离方法
2.1.4 菌株毒力的初筛
2.1.4.1 小菜蛾室内人工饲养
2.1.4.2 甜菜夜蛾室内人工饲养
2.1.4.3 感染方法
2.1.4.4 结果检查与统计分析
2.2 结果与分析
2.2.1 土壤样品中苏云金芽孢杆菌的分离
2.2.2 对小菜蛾和甜菜夜蛾的生物测定
2.3 小结与讨论
3 苏云金芽孢杆菌WB9的生理生化试验
3.1 材料与方法
3.1.1 供试菌株
3.1.2 生理生化试验
3.1.2.1 各种糖的利用
3.1.2.2 淀粉的水解
3.1.2.3 乙酰甲基甲醇(V.P)反应
3.1.2.4 明胶解盶反应
3.1.2.5 脲酶水解反应
3.1.2.6 七叶灵的利用
3.1.2.7 卵磷酯酶试验
3.1.2.8 精氨酸脱羧酶试验
3.1.2.9 菌膜形成
3.2 结果与分析
3.3 小结与讨论
4 苏云金芽孢杆菌WB9编码活性因子的基因分析
4.1 材料与方法
4.1.1 供试菌株
4.1.2 培养基
4.1.3 试剂及缓冲液
4.1.3.1 试剂
4.1.3.2 缓冲液
4.1.4 总DNA的提取及定量
4.1.5 寡核苷酸引物
4.1.6 PCR扩增反应
4.1.7 PCR产物回收
4.1.8 酶切反应
4.1.9 电泳分析
4.2 结果与分析
4.2.1 cry1类基因型的PCR-RFLP分析
4.2.2 cry1Ab基因型的特异PCR分析
4.2.3 cry1Ab基因型PCR-RFLP分析
4.2.4 编码VIP的vip3A基因分析
4.2.5 编码几丁质酶的基因分析
4.2.6 编码肠毒素的基因分析
4.3 小结与讨论
5 cry1Ab17基因的克隆、序列分析及表达
5.1 材料与方法
5.1.1 材料
5.1.1.1 供试菌株
5.1.1.2 质粒载体
5.1.1.3 培养基
5.1.1.4 试剂盒
5.1.1.5 酶类
5.1.1.6 缓冲液
5.1.2 方法
5.1.2.1 PCR简易模板的制备
5.1.2.2 寡核苷酸引物设计
5.1.2.3 目的片段的扩增
5.1.2.4 琼脂糖凝胶中回收PCR产物
5.1.2.5 PCR产物加A尾
5.1.2.6 连接反应
5.1.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备
5.1.2.8 转化
5.1.2.9 质粒提取
5.1.2.10 酶切反应
5.1.2.11 DNA序列测定及分析
5.1.2.12 目的蛋白的诱导表达
5.1.2.13 生物测定
5.2 结果与分析
5.2.1 cry1Ab-WB9基因的克隆和序列分析
5.2.1.1 cry1Ab-WB9基因的扩增及重组质粒酶切分析
5.2.1.2 cry1Ab-WB9基因的序列分析
5.2.1.3 系统发育树
5.2.1.4 Cry1Ab17蛋白的结构预测和分析
5.2.2 cry1Ab17基因在E.coli中的表达
5.2.2.1 原核表达载体pET-29a-cry1Ab17的构建
5.2.2.2 目的蛋白Cry1Ab17的诱导表达
5.2.2.3 表达产物Cry1Ab17蛋白的杀虫活性
5.3 小结与讨论
6 WB9工业培养基的优化及其发酵液对茶叶害虫的防效
6.1 材料与方法
6.1.1 供试菌株
6.1.2 培养基
6.1.3 工业培养基的碳、氮源优化
6.1.4 工业培养基的无机盐优化
6.1.5 摇瓶培养
6.1.6 对茶尺蠖幼虫的室内生物测定
6.1.7 对茶尺蠖幼虫的田间小区防治
6.2 结果与分析
6.2.1 培养基碳、氮源的优化初筛
6.2.2 无机盐浓度的优化初筛
6.2.3 对茶尺蠖幼虫的室内致病力测定和田间防治
6.3 小结与讨论
参考文献
附录一 缩写词英汉对照
附录二 博士研究生期间发表及投稿的论文
附录三 博士研究生期间主持及参加的课题
附录四 Cry1Ab17基因及其编码蛋白序列GenBank登录号
致谢
发布时间: 2005-09-27
参考文献
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