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HBV感染影响TRAIL诱导凋亡关键基因片段的筛选及其分子机制的研究

2020-11-23阅读(744)

HBV感染影响TRAIL诱导凋亡关键基因片段的筛选及其分子机制的研究

论文摘要

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染肝细胞所致肝炎、肝硬化甚至肝癌是危及全世界，尤其是我国人民健康的重要原因。尽管到目前为止，HBV的确切致病机制尚存在争议，但已有研究证实，HBV感染所致肝细胞凋亡失衡不仅是乙肝患者肝细胞损伤的重要分子机制之一，而且在乙肝患者不同的预后、转归中发挥着不容忽视的、甚至是决定性的作用。 众多研究表明，TNFα、FasL等凋亡诱导分子在HBV感染所致肝细胞损伤中发挥重要作用。肿瘤坏死因子凋亡诱导配体（Tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL）是于1994年被克隆、命名的肿瘤坏死因子家族成员，其最为显著的特点是：可选择性地诱导肿瘤细胞或者病毒感染细胞的凋亡，而对正常组织细胞无明显毒性。研究发现，许多因素（病毒／病毒编码蛋白、射线、药物等）可改变细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性。我室在前期研究中首次提出并报道了，HBV感染可提高肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性，可能在HBV感染所致肝细胞损伤中发挥一定的作用。但是，HBV全基因组至少包含四个开放性读码框架（Open reading frame，ORF），编码合成相应病毒蛋白质，那么究竟哪一个片段是导致HBV影响TRAIL诱导凋亡的关键性基因区段呢?这些关键性基因区段在TRAIL诱导凋亡通路中的关键性作用位点又是什么呢?因此，在前期工作的基础上，本课题在国内外率先开展了有关HBV影响TRAIL诱导凋亡的机制研究，并取得了一定的研究成果。

论文目录

  • 中文部分
  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 符号说明
  • 前言
  • 总体技术路线
  • 第一部分 影响TRAIL诱导凋亡的HBV基因片段的筛选及其作用研究
  • 第一节 反义封闭HBx、HBpreS2表达的体外抗病毒效应
  • 材料与方法
  • 1.材料
  • 2.方法
  • 2.1 PS-asODNs／HBx、PS-asODNs／preS2的设计、合成和溶解
  • 2.2 PS-asODNs／HBx、PS-asODNs／preS2的体外抗病毒效应
  • 结果
  • 1.PS-asODNs／HBx、PS-asODNs／preS2对HBV抗原表达的影响
  • 2.PS-asODNs／HBx、PS-asODNs／preS2对HBV DNA含量的影响
  • 讨论
  • 第二节 反义封闭HBx、HBpreS2的表达对TRAIL诱导细胞凋亡的影响
  • 材料与方法
  • 1.材料
  • 2.方法
  • 2.1 HepG2.2.15细胞对TRAIL敏感性的检测
  • 2.2 反义封闭HBx、HBpreS2的表达对TRAIL诱导细胞凋亡的影响
  • 结果
  • 1.HepG2.2.15细胞对TRAIL敏感性的检测
  • 1.1 倒置显微镜下观察形态学变化
  • 1.2 MTT法检测细胞杀伤率
  • 1.3 可溶性DR5蛋白阻断TRAIL的细胞毒效应
  • 2.反义封闭HBx、HBpreS2的表达对TRAIL诱导细胞凋亡的影响
  • 2.1 倒置显微镜下观察形态学变化
  • 2.2 MTT法检测细胞杀伤率
  • 2.3 TUNEL流式细胞术检测细胞凋亡
  • 讨论
  • 第三节 反义封闭HBx、HBpreS2对TRAIL受体表达的影响
  • 材料与方法
  • 1.材料
  • 2.方法
  • 2.1 半定量RT-PCR检测TRAIL受体mRNA水平的表达
  • 2.2 Western blot检测TRAIL受体蛋白质水平的表达
  • 2.3 流式细胞术检测TRAIL受体蛋白质水平的表达
  • 结果
  • 1.半定量RT-PCR检测TRAIL受体mRNA水平的表达
  • 2.Western blot检测TRAIL受体蛋白质水平的表达
  • 3.流式细胞术检测TRAIL受体蛋白质水平的表达
  • 讨论
  • 小结
  • 第二部分 HBx、MHBs（t）的表达对TRAIL诱导凋亡的影响及其机制的体外研究
  • 第一节 含HBx、MHBs（t）基因片段真核表达载体的构建及表达
  • 技术路线
  • 材料与方法
  • 1.材料
  • 2.方法
  • 2.1 HBx、MHBs（t）基因片段的PCR扩增、回收及纯化
  • 2.2 目的基因与载体的连接和重组子的转化
  • 2.3 阳性重组子的筛选与鉴定
  • 2.4 HBx、MHBs（t）基因稳定转染肝癌细胞系的建立及其鉴定
  • 结果
  • 1.HBx、MHBs（t）基因片段的PCR扩增、回收及纯化
  • 1.1 PCR扩增HBx、MHBs（t）基因片段
  • 1.2 回收、纯化PCR产物
  • 2.pcDNA-HBx、pcDNA-MHBs（t）真核表达载体的构建及鉴定
  • 2.1 目的基因和载体的酶切回收
  • 2.2 目的基因与载体的连接、转化
  • 2.3 阳性重组子的筛选和鉴定
  • 3.HBx、MHBs（t）基因稳定转染肝癌细胞系的建立及其鉴定
  • 3.1 试剂盒小量提取质粒
  • 3.2 肝癌细胞系BEL7402对TRAIL敏感性的检测
  • 3.3 阳性细胞克隆的筛选
  • 3.4 稳定筛选细胞的鉴定
  • 讨论
  • 第二节 HBx、MHBs（t）的表达对TRAIL诱导凋亡的影响
  • 材料与方法
  • 1.材料
  • 2.方法
  • 2.1 MTT法检测不同浓度TRAIL对细胞生长的抑制效应
  • 2.2 倒置显微镜下观察形态学变化
  • 2.3 TUNEL流式细胞术检测TRAIL诱导的凋亡效应
  • 结果
  • 1.MTT法检测细胞杀伤率
  • 2.倒置显微镜下形态学观察
  • 3.TUNEL流式细胞术检测细胞凋亡率
  • 讨论
  • 第三节 HBx、MHBs（t）的表达促进TRAIL诱导凋亡的机制研究
  • 技术路线
  • 材料与方法
  • 1.材料
  • 2.方法
  • 2.1 胞膜受体水平的检测
  • 2.2 胞浆凋亡通路水平的检测
  • 结果
  • 1.HBx、MHBs（t）的表达对TRAIL受体水平的影响
  • 1.1 半定量RT-PCR检测TRAIL受体mRNA水平的表达
  • 1.2 Western blot检测TRAIL受体蛋白质水平的表达
  • 1.3 流式细胞术检测TRAIL受体蛋白质水平的表达
  • 2.HBx、MHBs（t）的表达对TRAIL凋亡通路分子表达或活化的影响
  • 2.1 Caspase 3活化水平的检测
  • 2.2 线粒体非依赖途径
  • 2.3 线粒体依赖途径
  • 讨论
  • 第四节 小干扰RNA封闭Bax的表达对HBx影响TRAIL诱导凋亡的逆转效应
  • 技术路线
  • 材料与方法
  • 1.材料
  • 2.方法
  • 2.1 阳性对照小干扰RNA载体对GAPDH表达的抑制效率
  • 2.2 有效封闭Bax表达的小干扰RNA载体的筛选
  • 2.3 封闭Bax的表达对HBx上调TRAIL诱导凋亡的影响
  • 2.4 封闭Bax的表达对TRAIL凋亡通路分子活化水平的影响
  • 结果
  • 1.阳性对照小干扰RNA载体有效抑制GAPDH的表达
  • 1.1 成功构建GAPDH小干扰RNA载体和阴性对照载体
  • 1.2 阳性对照小干扰RNA载体有效抑制GAPDH的表达
  • 2.有效封闭Bax表达的小干扰RNA载体的筛选
  • 2.1 Bax小干扰RNA载体的DNA测序结果及序列分析
  • 2.2 小干扰RNA载体对Bax表达的抑制效应
  • 3.封闭Bax的表达可逆转HBx对TRAIL诱导凋亡的影响
  • 4.封闭Bax的表达对TRAIL凋亡通路分子活化水平的影响
  • 讨论
  • 小结
  • 第三部分 HBx的表达影响TRAIL诱导凋亡的体内研究
  • 技术路线
  • 材料与方法
  • 1.材料
  • 2.方法
  • 2.1 试剂盒大量提取质粒pcDNA3、pcDNA-HBx
  • 2.2 腺病毒的体外扩增、滴度测定及体外活性检测
  • 2.3 HBx基因及TRAIL腺病毒在小鼠肝组织内的表达
  • 2.4 HBx的表达对TRAIL腺病毒介导的肝脏损伤的影响
  • 结果
  • 1.试剂盒大量提取质粒
  • 2.TRAIL腺病毒的体外扩增、滴度测定和体外活性检测
  • 2.1 倒置显微镜下观察腺病毒感染后的细胞病变
  • 2.2 空斑形成试验测定病毒滴度
  • 2.3 TRAIL腺病毒体外活性检测
  • 3.HBx在小鼠肝组织内的表达
  • 3.1 半定量RT-PCR检测HBx mRNA水平的表达
  • 3.2 Western blot检测HBx蛋白质水平的表达
  • 4.HBx的表达增强TRAIL腺病毒诱导肝细胞凋亡
  • 4.1 小鼠血清谷丙转氨酶水平
  • 4.2 各器官组织病理学改变
  • 4.3 PI流式细胞术检测肝细胞凋亡
  • 讨论
  • 小结
  • 英文部分
  • Preface
  • Part I Preliminary screening and study of valuable HBV fragments for effects on TRAIL-induced apoptosis
  • Section 1 Effects of blocking HBx, HBpreS2 expression on HBV antigen synthesis and HBV DNA replication
  • Materials and methods
  • 1. Materials
  • 2. Methods
  • 2.1 Design,synthesis and preparation of PS-asODNs/HBx,PS-asODNs/preS2
  • 2.2 Antiviral effects of PS-asODNs/HBx, PS-asODNs/preS2 in vitro
  • Results
  • 1. Inhibition of PS-asODNs/HBx, PS-asODNs/preS2 on the expression of HBsAg, HBeAg
  • 2. Inhibition of PS-asODNs/HBx, PS-asODNs/preS2 on HBV DNA 134 Discussion
  • Section 2 Effects of blocking HBx, HBpreS2 expression on TRAIL-induced apoptosis
  • Materials and methods
  • 1. Materials
  • 2. Methods
  • 2.1 Sensitivity of HepG2.2.15 cells towards TRAIL
  • 2.2 Effects of blocking HBx, HBpreS2 expression on TRAIL-induced apoptosis
  • Results
  • 1. Sensitivity of HepG2.2.15 towards TRAIL
  • 1.1 Morphological changes
  • 1.2 Results of MTT assay
  • 1.3 Blockade of TRAIL cytotoxicity by sDR5
  • 2. Effects of blocking HBx, HBpreS2 expression on TRAIL-induced apoptosis l40
  • 2.1 Morphological changes
  • 2.2 Cytotoxicity rate detected by MTT assay
  • 2.3 Apoptosis rate detected by TUNEL
  • Discussion
  • Section 3 Effects of blocking HBx, HBpreS2 on the level of TRAIL receptors 142 Materials and methods
  • Materials and methods
  • 1. Materials
  • 2. Methods
  • 2.1 mRNA expression of TRAIL receptors
  • 2.2 Protein expression of TRAIL receptors detected by Western blot
  • 2.3 Protein expression of TRAIL receptors detected by FCM
  • Results
  • 1. mRNA expression of TRAIL receptors detected by RT-PCR
  • 2. Protein expression of TRAIL receptors detected by Western blot
  • 3. Protein expression of TRAIL receptors detected by FCM
  • Discussion
  • Conclusion
  • Part II Effects of HBx,MHBs（t） on TRAIL-indcued apoptosis and their molecular mechanisms in vitro
  • Section 1 Construction and expression of eukaryotic expression vectors containing HBx or MHBs（t）
  • Materials and methods
  • 1. Materials
  • 2. Methods
  • 2.1 Amplification, extraction and purification of HBx and MHBs（t） genes
  • 2.2 Ligation and Transformation
  • 2.3 Screening and identification of positive recombinants
  • 2.4 Establishment and identification of stably-transfected hepatoma cells
  • Results
  • 1. Amplification, retrieval and purification of HBx, MHBs（t） genes
  • 1.1 PCR amplification of HBx and MHBs（t） genes
  • 1.2 Retrieval and purification of PCR products
  • 2. Construction and identification of pcDNA-HBx and pcDNA-MHBs（t）
  • 2.1 Digestion and retrieval of interest genes and vectors
  • 2.2 Ligation and transformation
  • 2.3 Screening and identification of positive clones
  • 3. Establishment and identification of stably transfected hepatoma cells
  • 3.1 Extraction of recombinant plasmids
  • 3.2 Sensitivity of BEL7402 towards TRAIL
  • 3.3 Screening of postivie clones
  • 3.4 Identification of stably-transfected cells
  • Discussion
  • Section 2 Effects of HBx and MHBs（t） expression on TRAIL-induced apoptosis 161 Materials and methods
  • Materials and Methods
  • 1. Materials
  • 2. Methods
  • 2.1 Cytotoxicity of TRAIL
  • 2.2 Morphologic changes of cells induced by TRAIL
  • 2.3 Apoptosis rate detected by TUNEL
  • Results
  • 1. Cytotoxicity rate detected by MTT
  • 2. Morphorlogic changes under inverted microscope
  • 3. Apoptosis rates detected by TUNEL
  • Discussion
  • Section 3 Molecular mechanisms of HBx and MHBs（t） effects on TRAIL-induced apoptosis
  • Materials and methods
  • 1. Materials
  • 2. Methods
  • 2.1 Extracellular detection
  • 2.2 Intracellular detection
  • Results
  • 1. Effects of HBx and MHBs（t） on the expression of TRAIL receptors
  • 1.1 Semi-quantitative RT-PCR
  • 1.2 Western blot
  • 1.3 Flow cytometry
  • 2. Effects of HBx,MHBs（t） on TRAIL-pathway molecules
  • 2.1 Activation level of caspase 3
  • 2.2 Mitochondria-independent pathway
  • 2.3 Mitochondria-dependent pathway
  • Discussion
  • Section 4 Reversion of Bax siRNA on HBx-enhanced TRAIL-induced apoptosis.178 Materials and methods
  • Materials and methods
  • 1. Materials
  • 2. Methods
  • 2.1 Inhibition of positive control siRNA vector on GAPDH
  • 2.2 Selection of effective siRNA vector for Bax
  • 2.3 Effects of Bax blockade on HBx-enhanced TRAIL-induced apoptosis
  • 2.4 Effects of Bax blockade on the activation of TRAIL-signaling molecules 183 Results
  • Results
  • 1. Inhibition of positive control siRNA vector on GAPDH
  • 1.1 Successful construction of positive and negative siRNA vectors
  • 1.2 Effective inhibition of GAPDH by positive control siRNA vector
  • 2. Selection of efficient siRNA vector for Bax
  • 2.1 DNA sequencing of Bax siRNA vectors
  • 2.2 Inhibition of Bax expression by siRNA vector
  • 3. Reversion of Bax siRNA on HBx-enhanced TRAIL-induced apoptosis
  • 4. Effects of Bax siRNA on the activation of apoptotic pathway molecules
  • Discussion
  • Conclusion
  • Part III Study of HBx effects on TRAIL-induced apoptosis in vivo
  • Materials and methods
  • 1. Materials
  • 2. Methods
  • 2.1 Extraction ofpcDNA3 and pcDNA-HBx in bulk
  • 2.2 In vitro amplification, titration, activity detection of adenovirus
  • 2.3 Expression of HBx and Ad-TRAIL in mouse liver
  • 2.4 Effects of HBx on the liver injury induced by TRAIL adenovirus
  • Results
  • 1. Extraction of plasmids in bulk
  • 2. Amplification, titration and activity detection of adenovirus
  • 2.1 Cytopathic effects of HEK293 cells infected with adenovirus
  • 2.2 Plaque formation assay
  • 2.3 Activity of TRAIL adenovirus
  • 3. Expression of HBx in mouse liver
  • 3.1 Semi-quantitative RT-PCR for HBx mRNA
  • 3.2 Western blot for HBx protein
  • 4. Effects of HBx expression on TRAIL-induced apoptosis in vivo
  • 4.1 ALT level in serum
  • 4.2 Pathological changes in different tissues
  • 4.3 Apoptosis of hepatocytes
  • Discussion
  • Conclusion
  • 中英文共用目录
  • 附图
  • 参考文献
  • 致谢
  • Acknowledgements
  • 博士在读期间发表论文、论著目录及所获荣誉
  • Publications and honors
  • 学位论文评阅及答辩情况表

    • 相关论文文献

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