荔枝多酚氧化酶基因的克隆与表达分析

论文摘要

荔枝(Litchi chinensis Sonn.)是华南最重要的果树之一。但果实采后快速褐变缩短了货架期,降低了果实商品价值,是限制荔枝产业发展的主要因素之一。采后生理学研究证实,酶促褐变是果皮褐变的主要原因,其中多酚氧化酶在酶促褐变过程中起主要作用。但有关荔枝多酚氧化酶分子生物学的研究未见报道。克隆荔枝PPO基因,探明果皮褐变与PPO酶活性变化及基因表达之间的关系,可为进一步揭示果皮褐变机制,进而开发有关采后处理技术提供依据。本研究以妃子笑、紫娘喜、南岛无核荔、大丁香、小丁香、新球蜜荔果实为试材,比较研究了不同温度,不同包装处理及炭疽侵染条件下不同品种果皮褐变进程及生理变化的差异。通过同源克隆、RACE技术和基因步移等方法,获得了不同耐贮性荔枝品种PPO基因,进一步研究了PPO基因的表达规律。主要结果如下：各品种荔枝果实耐贮性不同,紫娘喜最耐贮藏,南岛无核荔最不耐贮藏,其余品种居中。最耐贮的紫娘喜果皮PPO活性、POD活性、褐变指数、果皮失水率、PH值、总酚含量等变化幅度,明显低于最不耐贮的南岛无核荔。用同源克隆、RACE及染色体步移等方法相结合,克隆到无核荔枝、妃子笑、南岛无核荔枝的PPO基因的cDNA和gDNA全长。对获得的荔枝PPO基因的进行生物信息学分析,发现PPO基因cDNA全长2091bp,含有一个1800bp的完整开放阅读框,编码599个氨基酸残基的多肽,其推导的氨基酸序列含有三个保守结构域,编码蛋白为亲水性不稳定蛋白,其中含有较多的Ala和Thr；其编码的氨基酸与蓖麻、毛果杨、大叶钻天杨、酸枣等植物相比具有较高的同源性；通过对三品种PPO基因cDNA和gDNA序列及其氨基酸序列进行同源性比较,发现PPO基因含有内含子,三品种PPO基因同源性高且存在单核苷酸多态性位点,这些位点的存在可能是导致三品种褐变程度差异的原因。southern blot分析表明荔枝PPO基因为单拷贝基因。荧光定量PCR分析表明,PPO在不同组织中表达量不同,在果肉中表达量最低,在花中表达量最高；在果实发育过程中,PPO基因表达量低,变化平缓,而在成熟采摘后表达量迅速上升；随贮藏时间延长,果皮褐变指数升高,不同耐贮性品种果皮PPO基因表达均呈上调表达,贮藏后期表达量下调,其中最不耐贮的南岛无核荔果皮PPO基因表达比最耐贮的紫娘喜变化剧烈且表达量高；控制失水和低温贮藏可以降低PPO基因表达量,而真菌侵染可以提高PPO基因表达量。不同品种采后褐变指数变化都与PPO基因表达及酶活性正相关,随贮藏时间延长,果皮褐变指数升高,不同耐贮性品种果皮PPO基因表达及酶活性均呈上升趋势,贮藏后期下降,其中最不耐贮的南岛无核荔枝果皮PPO基因表达及活性比最耐贮的紫娘喜变化剧烈。不同处理采后褐变指数变化都与PPO基因表达及酶活性正相关,随贮藏时间延长,果皮褐变指数升高,不同处理下各品种果皮PPO基因表达及酶活性均呈上升趋势,贮藏后期下降,其中控制果皮失水下PPO酶活性和基因表达变化幅度相对果皮快速失水小且褐变慢；低温处理下PPO酶活性及基因表达变化相对室温明显降低,褐变时间明显延长；炭疽侵染下的妃子笑果皮的PPO酶活性及基因表达量急剧上升。综上所述,随贮藏时间延长,荔枝果皮褐变加重,果皮褐变与PPO基因表达量及活性变化有关。不同品种耐贮性差异与PPO表达量差异有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 序言
• 1.1 荔枝产业概述
• 1.2 荔枝采后生物学概述
• 1.2.1 荔枝果实概述
• 1.2.2 荔枝采后生理活动
• 1.2.3 荔枝采后果皮褐变机理
• 1.2.4 荔枝采后保鲜技术
• 1.3 荔枝采后分子生物学研究进展
• 1.4 植物多酚氧化酶研究进展
• 1.4.1 多酚氧化酶的生理功能研究
• 1.4.2 多酚氧化酶的生化性质
• 1.4.3 多酚氧化酶的分子生物学研究
• 1.5 多酚氧化酶的应用研究
• 1.6 本研究的目的意义
• 1.7 本研究技术路线
• 2 不同荔枝品种采后果皮褐变过程中一些生理变化的研究
• 2.1 材料
• 2.2 果实处理及取样方法
• 2.2.1 不同品种品种生理变化比较
• 2.2.2 耐贮性差异三品种生理变化比较
• 2.2.3 不同温度包装处理下妃子笑果实生理变化比较
• 2.2.4 妃子笑接种炭疽后多酚氧化酶活性比较
• 2.3 测定指标与方法
• 2.3.1 果皮褐变指数
• 2.3.2 果皮失水率
• 2.3.3 果皮pH值
• 2.3.4 果皮相对电导率
• 2.3.5 丙二醛（MDA）含量
• 2.3.6 酶活测定
• 2.3.7 果皮花色素苷和总酚含量
• 2.3.8 褐变潜力
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 不同荔枝品种生理变化比较
• 2.4.2 耐贮性差异三品种不同贮藏温度生理变化比较
• 2.4.3 不同温度包装处理下妃子笑生理活性变化
• 2.4.4 炭疽侵染下妃子笑PPO活性变化
• 2.4.5 褐变潜力
• 2.5 讨论
• 2.5.1 失水与PPO活性变化的关系
• 2.5.2 pH与PPO活性变化的关系
• 2.5.3 总酚与花色苷含量与PPO活性变化的关系
• 2.5.4 PPO和POD与果皮褐变的关系
• 2.5.5 温度与PPO活性变化及褐变的关系
• 2.5.6 品种与PPO活性变化的关系
• 2.5.7 包装处理与PPO活性变化的关系
• 2.5.8 炭疽侵染与PPO活性变化关系
• 3. 荔枝多酚氧化酶基因的克隆与表达分析
• 3.1 试剂、仪器、材料
• 3.1.1 实验试剂
• 3.1.2 实验仪器
• 3.1.3 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 荔枝基因组DNA提取
• 3.2.2 荔枝总RNA提取
• 3.2.3 cDNA第一链的合成
• 3.2.4 总RNA反应体系
• 3.2.5 荔枝PPO DNA片段克隆
• 3.2.6 荔枝PPO cDNA片段克隆
• 3.2.7 RACE技术扩增荔枝PPO cDNA 5'端和3'端
• 3.2.8 荔枝PPO DNA克隆
• 3.2.9 基因结构分析
• 3.2.10 Southern blot分析
• 3.2.11 荧光定量
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 荔枝基因组DNA提取
• 3.3.2 荔枝总RNA提取
• 3.3.3 荔枝PPO DNA克隆与分析
• 3.3.4 荔枝PPO cDNA克隆与分析
• 3.3.5 荔枝PPO cDNA与DNA比对
• 3.3.6 荔枝PPO氨基酸比对
• 3.3.7 PPO基因结构分析
• 3.3.8 southern杂交
• 3.3.9 荧光定量表达分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 PPO基因分析
• 3.4.2 荧光分析
• 4. 总的讨论
• 4.1 荔枝果皮褐变进程与PPO基因表达、酶活性变化之间的关系
• 4.2 不同品种褐变过程差异与PPO基因表达、酶活性之间的关系
• 4.3 不同处理荔枝果皮褐变与PPO基因表达、酶活性变化之间的关系
• 4.4 下一步的研究计划
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 缩略词