多杀菌素分离纯化的工艺研究

论文题目: 多杀菌素分离纯化的工艺研究

论文类型: 硕士论文

论文专业: 农药学

作者: 胡西洲

导师: 林开春

关键词: 农用抗生素,多杀菌素,刺糖多孢菌,大孔吸附树脂,溶媒萃取

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 绿色广谱生物杀虫剂多杀菌素是由放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)发酵产生的次生代谢产物,它具有高效、低毒、低残留和对环境友好等优点。本课题主要目的就是运用溶剂萃取法和树脂吸附法从发酵液中提取多杀菌素,确定较为合理的工艺方法和参数以及分离纯化工艺路线。首先,本文建立了关于多杀菌素的快速定量分析检测方法,包括薄层层析法和高效液相色谱法。其中建立的高效液相色谱法具有快速、准确等特点,适用于测定发酵液及各种分离过程中的多杀菌素的含量。其最佳色谱条件如下:色谱柱:碳十八烷基硅胶键合柱;流动相:甲醇∶乙腈∶水(含0.05%乙酸铵)=49∶49∶2;检测波长:246nm;流速:1ml/min;进样量:10μl;柱温:室温。在溶剂萃取法中,优化后的条件为:发酵液调至pH9.0,加入等体积丙酮,浸提8h,离心后取上清液,经减压浓缩后,再以等体积的乙酸乙酯萃取三次,再次浓缩到1/3的原体积时,用0.2mol/L的酒石酸溶液反萃取,得到的水相调pH为9.0时析出固体,真空干燥得到多杀菌素成品。在树脂吸附法研究中,筛选出非极性的XAD-4树脂作为吸附剂,优化后的吸附条件为:pH值为11;吸附流速为1/6(1/min);加入2%氯化钠(W/V);吸附量可达1.09×10~4μg/ml湿树脂。优化后的洗脱条件:采用梯度洗脱的方式,以丙酮为洗脱剂,低浓度区内(0～70%)大量杂质及色素被洗脱:高浓度区(70%～95%)内有效成分被洗脱,伴有少量杂质和色素。结果表明:溶剂萃取法的回收率为68.27%,纯度达91%;树脂吸附法的回收率64.27%,纯度95%。得到的精制品与多杀菌素标准品的质谱图比较表明,两者为同一物质。另外,室内生物测定结果表明:本品对几类分别属于鳞翅目、双翅目、缨翅目鞘翅目、同翅目的试虫都有很好的生物活性。

论文目录:

摘要

Abstract

1 前言

1．1 生物农药的研究概况

1．2 多杀菌素的理化性质

1．2．1 多杀菌素的组分及其结构

1．2．2 多杀菌素的理化性质

1．3 多杀菌素的生物学特性

1．3．1 作用机制

1．3．2 环境稳定性

1．3．3 生物学毒性

1．4 多杀菌素的生物合成途径

1．4．1 聚酮链的生物合成

1．4．2 三甲氧基鼠李糖的生物合成与连接

1．4．3 福乐糖胺的生物合成

1．5 多杀菌素的发酵生产

1．6 多杀菌素的分离纯化

1．6．1 抗生素的一般分离纯化方法

1．6．2 多杀菌素的分离纯化

1．7 多杀菌素的分析检测

1．8 多杀菌素的应用研究现状及展望

1．9 本文研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 供试菌种

2．1．2 培养基

2．1．3 标准品

2．1．4 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 多杀菌素定量分析方法

2．2．2 菌种发酵培养

2．2．3 发酵液的预处理方法

2．2．4 有机溶剂直接浸提方法

2．2．5 浸提液的离心分离

2．2．6 浸提液的浓缩方法

2．2．7 浓缩液的溶剂萃取

2．2．8 浸提液的大孔树脂吸附法

2．2．9 薄层层析法

2．2．10 柱层析色谱

2．2．11 发酵液的相关性质研究

2．2．12 多杀菌素室内生物活性测定方法

2．3 数据处理方法

3 结果与分析

3．1 多杀菌素分析方法的建立

3．1．1 薄层层析法

3．1．2 HPLC定量分析方法的建立

3．2 发酵液的相关性质研究

3．2．1 发酵液在酸碱环境中稳定性实验

3．2．2 发酵液的温度稳定性实验

3．3 发酵液预处理

3．3．1 Al_2(SO_4)_3加量和pH对预处理的影响

3．3．2 不同预处理剂的比较

3．4 溶媒萃取法提取多杀菌素的工艺研究结果

3．4．1 不同溶剂对发酵液的浸提效果分析

3．4．2 浸提液的浓缩过程分析

3．4．3 浓缩液的溶剂萃取分析

3．4．4 酒石酸反萃取率分析

3．4．5 多杀菌素的酒石酸盐溶液调碱对多杀菌素析出的影响

3．5 树脂吸附法提取多杀菌素的工艺研究结果

3．5．1 树脂的选型

3．5．2 最佳吸附条件的研究

3．5．3 解吸剂的选择

3．5．4 树脂再生后吸附洗脱性能分析

3．5．5 树脂放大实验

3．5．6 脱色剂的选择

3．6 溶媒萃取法与树脂吸附法的工艺比较

3．7 多杀菌素的精制及结构鉴定

3．7．1 柱层析色谱

3．7．2 多杀菌素精制品的质谱鉴定

3．8 多杀菌素的室内生物活性测定

4 小结与讨论

参考文献

致谢

发布时间: 2005-12-05

参考文献

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