恶臭假单胞菌表面展示细菌漆酶及对染料的脱色性能

论文摘要

细菌表面展示系统是一种蛋白质应用新技术,已在多个生物技术领域显示出应用前景。本研究利用丁香假单胞菌冰晶核蛋白（Ice Nucleation Protein） InaQ的N-末端结构域作为运载蛋白,采用C-端融合的方法,将一种细菌漆酶成功展示在恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） AB92019菌株的表面,然后对3种不同重复单元InaQ-N、（InaQ-N）2和（InaQ-N）3作为运载蛋白表面展示细菌漆酶的性能进行了比较分析,并对优化系统进一步用于染料脱色的性能进行了研究。从携带细菌漆酶基因的重组质粒pMB172中通过PCR反应扩增得到突变型漆酶基因wlacD,然后酶切连接至分别含有1、2和3个inaQ-N基因重复的表达载体pMB104、pMB111和pMB112,构建得到分别含有融合基因inaQ-N-wlacD、（inaQ-N）2-wlacD和（inaQ-N）3-wlacD的重组质粒pMB281、pMB282和pMB283,并通过电转化导入恶臭假单胞菌AB92019菌株,筛选得到恶臭假单胞菌表面展示重组菌MB284、MB285和MB286。经对重组菌的SDS-PAGE、Western Blot、免疫荧光显微镜镜检以及流式细胞仪分析,结果证明重组菌MB284、MB285和MB286均能成功地在细胞表面分别展示其融合蛋白InaQ-N-WlacD、（InaQ-N）2-WlacD和（InaQ-N）3-WlacD。通过对3个重组菌全细胞漆酶酶活的检测发现,表面展示（InaQ-N）2-WlacD融合蛋白的重组菌MB285酶活最高,达到6.9U/mL。因此,选择重组菌MB285进行染料的脱色研究。选取酸性绿和酸性红2种染料进行脱色试验。实验结果发现,重组菌MB285对两种染料均具有明显的脱色性能,其中对酸性绿的脱色率达到35.5%,对酸性红的脱色率达到17%。对重组菌在优化培养条件下对两种染料的绝对脱色性能进行了考察。测定了重组菌MB285的全细胞酶活曲线,发现该曲线与重组菌的生长曲线具有同步性。通过单因子试验探讨重组菌MB285的摇瓶发酵条件（培养温度、初始pH、装液量和接种量）对生长量的影响。确定最佳培养条件为初始pH7.0,培养温度30℃,装液量20%和接种量4%。通过单因素和正交试验确定重组菌MB285发酵培养基的最佳配比为（W/V）2%葡萄糖、3%玉米浆、2%硫酸铵、0.2%氯化钠、0.08%MgSO4·7H2O和0.05% K2HPO4·3H2O。筛选出的优化培养基活菌数为1.1×1011CFU/mL,与优化前相比提高了约2.3倍。重组菌MB285摇瓶发酵优化后绝对脱色效率明显的提高,对酸性绿的绝对脱色率由优化前的36.5%提高到优化后的45%,对酸性红的绝对脱色率由优化前的17.9%提高到优化后的28%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 细菌表面展示技术及应用的研究进展
• 1.1.1 细菌表面展示技术的研究进展
• 1.1.1.1 细菌表面展示体系的组成
• 1.1.1.2 细菌表面展示系统的种类
• 1.1.2 细菌表面展示技术的应用现状
• 1.1.2.1 重组疫苗的开发
• 1.1.2.2 全细胞催化剂
• 1.1.2.3 环境修复方面的应用
• 1.1.2.4 展示多肽文库作为筛选工具
• 1.2 冰核蛋白作为运载蛋白的细菌表面展示体系研究进展
• 1.2.1 冰核蛋白概述
• 1.2.2 冰核蛋白的结构和功能
• 1.2.3 冰核蛋白在细菌细胞表面展示系统的应用
• 1.3 乘客蛋白—漆酶的研究进展
• 1.3.1 漆酶的性质概述
• 1.3.1.1 漆酶的结构特征
• 1.3.1.2 漆酶的理化特性
• 1.3.1.3 漆酶的氧化特性
• 1.3.2 细菌漆酶的研究进展
• 1.3.2.1 细菌漆酶的种类
• 1.3.2.2 细菌漆酶的结构特征
• 1.3.2.3 细菌漆酶的突变改造研究
• 1.3.2.4 细菌漆酶的应用
• 1.4 表面展示宿主菌—恶臭假单胞菌
• 1.5 细菌表面展示系统存在的问题与展望
• 1.6 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 实验动物
• 2.1.5 主要试剂
• 2.1.5.1 主要分子生物学试剂
• 2.1.5.2 质粒提取,质粒转化,质粒快检所需试剂
• 2.1.5.3 琼脂糖凝胶电泳所需试剂
• 2.1.5.4 SDS-PAGE所需试剂
• 2.1.5.5 Western Blot所需试剂
• 2.1.5.6 显微镜观察及流式细胞仪分析所用试剂
• 2.1.5.7 漆酶活性测定试剂
• 2.1.5.8 漆酶脱色所用试剂
• 2.1.6 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 重组质粒和重组菌株的构建
• 2.2.1.1 wlacD基因的扩增
• 2.2.1.2 大肠杆菌和恶臭假单胞菌质粒的提取
• 2.2.1.3 DNA体外重组
• 2.2.1.4 大肠杆菌DH5α的转化
• 2.2.1.5 恶臭假单胞菌的电转化法
• 2.2.1.6 大肠杆菌转化子和恶臭假单胞菌转化子的筛选鉴定
• 2.2.1.7 质粒稳定性分析
• 2.2.2 融合蛋白在细菌细胞表面的定位分析
• 2.2.2.1 细胞分级分离
• 2.2.2.2 样品处理及SDS-PAGE电泳
• 2.2.2.3 抗血清制备程序
• 2.2.2.4 Western Blot实验
• 2.2.2.5 免疫荧光显微镜镜检实验
• 2.2.2.6 流式细胞仪分析
• 2.2.3 全细胞漆酶酶活性的测定
• 2.2.4 全细胞漆酶对染料的脱色实验
• 2.2.5 全细胞漆酶对染料的绝对脱色分析实验
• 2.2.6 生长曲线绘制
• 2.2.7 重组菌摇瓶发酵工艺的初步优化
• 2.2.7.1 摇瓶发酵条件的优化
• 2.2.7.2 发酵培养基的优化
• 2.2.7.3 培养基的优化
• 2.2.7.4 分析方法
• 2.2.8 图像处理及统计分析
• 2.2.8.1 图像处理
• 2.2.8.2 统计分析及绘图
• 3 结果与分析
• 3.1 表面展示质粒载体的构建
• 3.1.1 多拷贝串联重复InaQ-N载体片段的获得
• 3.1.2 靶蛋白基因wlacD的扩增
• 3.1.3 多拷贝串联重复InaQ-N展示质粒的构建
• 3.2 重组恶臭假单胞菌的构建
• 3.3 靶蛋白—漆酶细胞表面定位分析
• 3.3.1 细胞分级分离的SDS-PAGE及Western Blot分析
• 3.3.2 免疫荧光显微镜镜检
• 3.3.3 流式细胞仪分析
• 3.4 载体pMB281,pMB282和pMB283在恶臭假单胞菌的稳定性
• 3.5 重组菌全细胞漆酶酶活的测定
• 3.6 重组菌MB285对染料的脱色效果分析
• 3.6.1 两种染料的最大吸收波长λm的确定
• 3.6.2 重组菌MB285对两种染料的脱色效果分析
• 3.7 重组菌MB285发酵条件及培养基的初步优化
• 3.7.1 重组菌MB285初始培养条件下的生长曲线和酶活曲线的测定
• 3.7.2 重组菌MB285摇瓶发酵条件的优化
• 3.7.2.1 温度对生长量的影响
• 3.7.2.2 初始pH对生长量的影响
• 3.7.2.3 装液量对生长量的影响
• 3.7.2.4 接种量对生长量的影响
• 3.7.3 重组菌MB285摇瓶发酵种龄的确定
• 3.7.4 重组菌MB285摇瓶发酵培养基的优化
• 3.7.4.1 碳源筛选
• 3.7.4.2 氮源筛选
• 3.7.4.3 培养基的单因素分析
• 3.7.4.4 正交试验优化培养基
• 3.8 重组菌MB285优化前后的绝对脱色效果分析
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 4.2.1 恶臭假单胞菌表面展示性能的分析
• 4.2.2 细菌漆酶对染料的脱色分析
• 4.2.3 细菌表面展示工程菌的展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录