生姜蛋白酶的双水相萃取纯化技术研究

论文摘要

本研究以生姜为原料,于2009-2011年在山东农业大学食品科学与工程学院功能食品研究室进行,主要研究了运用双水相萃取技术（ATPE）分离提取生姜中生姜蛋白酶的提取条件,分析了双水相成相因素对生姜蛋白酶萃取的影响,利用该技术得到了生姜蛋白酶的等电点及三步双水相萃取纯化生姜蛋白酶的流程。主要结果如下:1.单盐双水相体系的建立最佳PEG分子量为4000,PEG浓度为30%,选择盐种类为硫酸铵,浓度为10%,体系pH为8.0,操作温度选择室温,样品加入量为3 mL。此双水相体系的生姜蛋白酶上相酶活力回收和纯化倍数都最高,分别可达87.24%和1.85。2.缓冲盐双水相体系的建立最佳PEG分子量为4000,PEG浓度为20%,缓冲盐pH为6.5,缓冲盐浓度为10%,此双水相体系的上相酶活回收和纯化倍数都最高,分别达94.99%和1.86。3. PEG/（NH4）2SO4双水相体系及PEG/（NaH2PO4-Na2HPO4）双水相体系的各相平衡关系的线性方程各分子量PEG/（NH4）2SO4相平衡关系的线性方程分别为:y=613.33e-0.2139x;y=260.66e-0.2036x) ;y=178.46e-0.1969x;y=79.91e-0.174x;y=124.52e-0.2492x ; y=282.31e-0.4302x)。各分子量PEG /（NaH2PO4-Na2HPO4）相平衡关系的线性方程分别为:y=327.41e-0.2706x) ; y=170.9e-0.247x ; y=105.9e-0.2508x ; y=91.385e-0.3029x ; y=106.04e-0.4173x ; y=73.272e-0.3836x。4.交错分配法（cross partitioning）测定生姜蛋白酶的等电点（pI）通过交错分配法测定生姜蛋白酶的等电点,得出生姜蛋白酶的等电点有两个:即4.1和6.4,说明生姜蛋白酶含有两个组分而且属于酸性蛋白酶。5.三步双水相萃取提取和纯化生姜蛋白酶流程的建立建立了三步双水相萃取提取和纯化生姜蛋白酶的流程,其中第二步萃取加入的盐浓度为20%,量为10 mL,第三步萃取加入的盐浓度为12%,量为15 mL。6.双水相纯化蛋白效果检测生姜蛋白酶粗酶液通过分子筛层析Sephadex G-50后,得到两个蛋白峰,双水相萃取酶液仅得到一个蛋白峰,对所得蛋白峰测定其酶活,结果与粗酶液所得酶活相比酶活损失不大。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 双水相萃取技术
• 1.1.1 双水相萃取技术的原理
• 1.1.2 双水相萃取体系的特点
• 1.1.3 双水相萃取相关理论的发展
• 1.1.4 双水相萃取中影响蛋白酶分配的因素
• 1.1.5 双水相萃取的工艺流程
• 1.2 生姜蛋白酶的研究现状
• 1.2.1 生姜蛋白酶分类学地位
• 1.2.2 生姜蛋白酶分离与纯化
• 1.2.3 生姜蛋白酶开发与应用
• 1.3 本实验目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要仪器
• 2.4 生姜蛋白酶的提取
• 2.5 生姜蛋白酶活力测定
• 2.6 蛋白质含量的测定
• 2.7 单盐双水相体系的双水相萃取
• 2.7.1 单盐双水相体系最佳PEG 分子量的确定
• 2.7.2 单盐双水相体系最佳PEG 浓度的确定
• 2.7.3 单盐双水相体系最佳盐种类的确定
• 2.7.4 单盐双水相体系最佳盐浓度的确定
• 2.7.5 单盐双水相体系pH 的确定
• 2.7.6 单盐双水相体系温度的确定
• 2.7.7 单盐双水相体系所加电解质浓度的确定
• 2.7.8 单盐双水相体系加入样品的量的确定
• 2.7.9 生姜蛋白酶最佳单盐双水相萃取条件正交实验
• 2.8 缓冲盐双水相体系的建立
• 2P0₄-Na₂HP0₄）相图的绘制'>2.8.1 PEG/（NaH₂P0₄-Na₂HP0₄）相图的绘制
• 2.8.2 缓冲盐双水相体系最佳PEG 分子量的确定
• 2.8.3 缓冲盐双水相体系最佳PEG 浓度的确定
• 2.8.4 缓冲盐双水相体系最佳缓冲盐浓度的确定
• 2.8.5 缓冲盐双水相体系最佳缓冲盐pH 的确定
• 2.8.6 生姜蛋白酶最佳缓冲盐双水相萃取条件正交实验
• 2.9 单一盐和缓冲盐双水相体系的比较
• 2.10 双水相萃取生姜蛋白酶相平衡关系的研究
• 2.10.1 双水相体系的形成
• 4）₂S0₄ 相图的绘制'>2.10.2 PEG/（NH₄）₂S0₄相图的绘制
• 4）₂S0₄和PEG/（NaH₂P0₄-Na₂HP0₄）各相平衡关系的线性方程'>2.10.3 PEG/（NH₄）₂S0₄和PEG/（NaH₂P0₄-Na₂HP0₄）各相平衡关系的线性方程
• 4）₂S0₄ 双水相系统相图解析'>2.10.4 PEG 4000/（NH₄）₂S0₄双水相系统相图解析
• 2.11 交错分配法（cross partitioning）测定生姜蛋白酶的等电点（pI）
• 2.12 三步双水相萃取纯化生姜蛋白酶流程的建立
• 2.12.1 第二步双水相体系纯化生姜蛋白酶体系的建立
• 2.12.2 第三步双水相体系纯化生姜蛋白酶体系的建立
• 2.12.3 三步双水相萃取流程图的建立
• 2.13 双水相纯化蛋白效果检测
• 2.13.1 分离纯化液分子筛层析检测条件
• 2.13.2 生姜蛋白酶粗酶液通过分子筛层析Sephadex G-50 的图像
• 2.13.3 双水相萃取酶液通过分子筛层析Sephadex G-50 的图像
• 2.13.4 粗酶液和双水相萃取酶液通过分子筛层析Sephadex G-50 后峰的酶活力图比较
• 2.14 生姜蛋白酶提取纯化方法的比较
• 2.15 计算方法
• 3 结果与分析
• 3.1 单盐双水相萃取生姜蛋白酶体系的建立
• 3.1.1 单盐双水相体系最佳PEG 分子量的确定
• 3.1.2 单盐双水相体系最佳PEG 浓度的确定
• 3.1.3 单盐双水相体系最佳盐种类的确定
• 3.1.4 单盐双水相体系最佳盐浓度的确定
• 3.1.5 单盐双水相体系pH 对蛋白质分配平衡的影响
• 3.1.6 单盐双水相体系温度的确定
• 3.1.7 单盐双水相体系所加电解质浓度的确定
• 3.1.8 单盐双水相体系加入样品的量的确定
• 3.1.9 生姜蛋白酶最佳单盐双水相萃取条件正交实验
• 3.2 缓冲盐双水相萃取生姜蛋白酶体系的建立
• 2P0₄-Na₂HP0₄）相图的绘制'>3.2.1 PEG/（NaH₂P0₄-Na₂HP0₄）相图的绘制
• 3.2.2 缓冲盐双水相体系最佳PEG 分子量的确定
• 3.2.3 缓冲盐双水相体系最佳PEG 浓度的确定
• 3.2.4 缓冲盐双水相体系缓冲盐最佳浓度的确定
• 3.2.5 缓冲盐双水相体系最佳缓冲液pH 的确定
• 3.2.6 生姜蛋白酶最佳缓冲盐双水相萃取条件正交试验
• 3.3 单盐和缓冲盐两种双水相体系的比较
• 3.4 双水相萃取生姜蛋白酶相平衡关系的研究
• 3.4.1 双水相的形成过程
• 4）₂S0₄ 相图的绘制'>3.4.2 PEG/（NH₄）₂S0₄相图的绘制
• 4）₂S0₄ 各相平衡关系的线性方程'>3.4.3 不同分子量PEG/（NH₄）₂S0₄各相平衡关系的线性方程
• 2P0₄-Na₂HP0₄）各相平衡关系的线性方程'>3.4.4 不同分子量PEG/（NaH₂P0₄-Na₂HP0₄）各相平衡关系的线性方程
• 4）₂S0₄ 双水相系统相图的解析'>3.4.5 PEG 4000/（NH₄）₂S0₄双水相系统相图的解析
• 3.5 交错分配法（cross partitioning）测定生姜蛋白酶的等电点（pI）
• 3.6 三步双水相萃取纯化生姜蛋白酶体系的建立
• 3.6.1 第二步双水相体系纯化生姜蛋白酶体系的建立
• 3.6.2 第三步双水相体系纯化生姜蛋白酶体系的建立
• 3.6.3 三步双水相萃取流程图的建立
• 3.7 双水相纯化蛋白效果检测
• 3.7.1 生姜蛋白酶粗酶液通过分子筛层析Sephadex G-50 的图像
• 3.7.2 双水相萃取酶液通过分子筛层析Sephadex G-50 的图像
• 3.7.3 粗酶液和双水相萃取酶液通过分子筛层析Sephadex G-50 后峰的酶活力图
• 3.8 生姜蛋白酶提取纯化方法的比较
• 4 讨论
• 4.1 两种双水相体系的建立
• 4.2 双水相体系相平衡关系的研究
• 4.3 交错分配法（cross partitioning）测定生姜蛋白酶的等电点（pI）
• 4.4 三步双水相萃取提取和纯化生姜蛋白酶流程的建立
• 4.5 生姜蛋白酶提取纯化方法的比较
• 4.6 进一步研究方向
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况
• 攻读学位期间申请专利
• 攻读学位期间参与的课题
• 攻读学位期间参与获得的科研成果