木聚糖酶高产菌株的选育及其酶活提高的机理初探

论文摘要

半纤维素是自然界中含量丰富的可利用的可再生资源,其含量仅次于纤维素含量,半纤维素的主要组成部分是木聚糖（xylan）,约占植物细胞干重的35%。木聚糖酶是能够降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称,自从二十世纪八十年代木聚糖酶实现工业化以来,木聚糖酶在食品、饲料、造纸以及能源等产业中都表现出了较好的运用前景。但是,木聚糖酶的低生产率和高成本依然是影响其规模化工业应用的重要原因。因此,木聚糖酶高产菌的选育具有重要的经济和社会意义。本研究对实验室筛选保存的纤维素高效降解厌氧菌群SVY42进行了产酶情况的分析,研究了分别以巨菌草、甘蔗渣、废菇筒、羧甲基纤维素钠、滤纸、木聚糖作为碳源时菌群SVY42产CMC酶、p-葡萄糖苷酶和木聚糖酶的情况。结果显示,在以巨菌草、甘蔗渣、废菇筒、滤纸、木聚糖作为碳源时菌群SVY42的木聚糖酶活最高分别为0.23U、0.08 U、0.2 U、0.067U、0.35 U,以CMC作为碳源时菌群SVY42的CMC酶活最高,为0.14U。其中以木聚糖作为碳源时SVY42的木聚糖酶活最高为0.35U,最适产酶条件是：培养基初始pH值是8、反应温度是41℃、培养时间为4天。从菌群SVY42中,以木聚糖为底物筛选得到3株产木聚糖酶的菌株SVY42-1、SVY42-2和SVY42-3,选其中木聚糖酶活最高的菌株SVY42-1作为研究对象。对单菌SVY42-1进行16S rDNA鉴定,SVY42-1与已知菌株（Tissierella praeacuta）的最高同源性只有93.8%,因此,该菌株可能属于新的属。该菌的最适生长条件为：培养基初始pH值是8.0、反应温度是41℃、培养时间4天。最适发酵条件为：培养基初始pH值是8.0、反应温度是41℃、发酵时间5天。对菌株SVY42-1用亚硝酸进行诱变,筛选得到3株酶活较高的菌株,分别是SVY42-11、SVY42-12、SVY42-13,经测定木聚糖酶活分别提高了23%、10%、20%。同时,运用分子生物学的方法对诱变机理进行了初探,随机扩增多态性DNA （RAPD）分析和全菌粗蛋白SDS-PAGE分析都显现出了差异条带,因此,从基因组和蛋白组水平上表明了变菌株SVY42-11、SVY42-12、SVY42-13和出发菌株SVY42-1均存在着差异。由于筛得的SVY42-1为已知的菌株,且诱变后菌株的酶活也没有达到理想水平,因此,又从菌群SVY42的宏基因组文库出发,去试图探索得到新的或酶活较高的木聚糖酶基因。本研究对从宏基因组文库中筛选木聚糖酶基因做了一些基础的研究,构建了pUC19表达载体,同时,以能够降解木聚糖的阳性克隆子（SVY42-C1）为研究对象,构建了亚克隆文库。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 木聚糖
• 1.2 木聚糖酶
• 1.2.1 木聚糖酶的来源
• 1.2.2 木聚糖酶的理化性质
• 1.2.3 木聚糖酶的分子结构
• 1.2.4 木聚糖酶的催化机制
• 1.2.5 木聚糖酶的应用
• 1.3 微生物诱变育种
• 1.3.1 物理诱变
• 1.3.2 化学诱变
• 1.4 宏基因组文库
• 1.4.1 宏基因组文库的构建
• 1.4.2 宏基因组文库在发现木聚糖基因方面的应用
• 1.5 本研究的目的意义和研究内容
• 第二章 厌氧菌群SVY42的产酶条件分析
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要溶液和培养基的配置
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要仪器设备
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 厌氧培养基的配制
• 2.3.2 粗酶液的制备
• 2.3.3 葡萄糖标准曲线的制定
• 2.3.4 木糖标准曲线的制定
• 2.3.5 内切葡聚糖酶（EG）酶活（CMC酶活）的测定
• 2.3.6 β-葡萄糖苷酶（BGL）酶活的测定
• 2.3.7 木聚糖酶酶活的测定
• 2.3.8 菌群SVY42在不同碳源培养条件下三种酶活的测定
• 2.3.9 菌群SVY42产木聚糖酶的发酵条件分析
• 2.4 结果分析与讨论
• 2.4.1 葡萄糖标准曲线的制定
• 2.4.2 木糖标准曲线的制定
• 2.4.3 不同碳源培养条件下菌群的三种酶活的大小
• 2.4.4 不同碳源下的木聚糖酶酶活
• 2.4.5 菌群SVY42产木聚糖酶的发酵条件分析
• 2.5 小结
• 第三章 木聚糖酶产生菌的筛选
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 样品
• 3.1.2 主要溶液和培养基的配置
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 厌氧培养基的配制
• 3.2.2 产木聚糖酶单菌的分离和纯化
• 3.2.3 菌株生长条件的测定
• 3.2.4 菌株发酵条件分析
• 3.2.5 菌株的复筛
• 3.3 结果分析与讨论
• 3.3.1 产木聚糖酶菌株的筛选结果
• 3.3.2 菌株SVY42-1、SVY42-2、SVY42-3木聚糖酶活的大小
• 3.3.3 菌株SVY42-1生长条件的确定
• 3.3.4 菌株SVY42-1发酵条件的确定
• 3.4 小结
• 第四章 菌株SVY42-1的生物信息学鉴定
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 样品
• 4.1.2 菌株与质粒
• 4.1.3 引物
• 4.1.4 主要分析软件
• 4.1.5 主要试剂
• 4.1.6 主要仪器设备
• 4.1.7 主要溶液和培养基的配置
• 4.2 菌株SVY42-1的分子生物学鉴定
• 4.2.1 菌株的培养
• 4.2.2 菌株基因组DNA的提取
• 4.2.3 16S rDNA基因的PCR扩增
• 4.2.4 PCR结果检测
• 4.2.5 PCR产物回收
• 4.2.6 连接反应
• 4.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 4.2.8 连接产物转化
• 4.2.9 菌落PCR选取阳性克隆子
• 4.2.10 核酸序列测定与序列比对分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 菌株基因组DNA的提取
• 4.3.2 16S rDNA保守序列的扩增
• 4.3.3 胶回收验证
• 4.3.4 菌落PCR验证
• 4.3.5 单菌的鉴定与系统进化树
• 4.4 小结
• 第五章 菌株SVY42-1的化学诱变、筛选和诱变机理的初探
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 培养基和主要溶液的配置
• 5.1.3 主要仪器设备
• 5.1.4 实验试剂
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 菌悬液的制备
• 5.2.2 菌株SVY42-1的亚硝酸诱变
• 5.2.3 蛋白质定量测定
• 5.2.4 木聚糖酶高产突变株与原始菌株SDS-PAGE分析
• 5.2.5 木聚糖酶高产突变菌株与出发菌株RAPD分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 诱变结果
• 5.3.2 从诱变株中筛选木聚糖酶高产菌株
• 5.3.3 蛋白质标准曲线
• 5.3.4 木聚糖酶高产突变株与出发菌株差异蛋白分析
• 5.3.5 木聚糖酶高产突变菌株与出发菌株RAPD分析
• 5.4 小结
• 第六章 SVY42-C1亚克隆文库的构建
• 6.1 实验材料
• 6.1.1 菌株与质粒
• 6.1.2 培养基
• 6.1.3 主要试剂的配置
• 6.1.4 主要仪器设备
• 6.1.5 实验试剂
• 6.2 试验方法
• 6.2.1 质粒DNA的提取
• 6.2.2 双酶切
• 6.2.3 质粒DNA的部分酶切
• 6.2.4 pUC19载体的构建
• 6.2.5 连接
• 6.2.6 转化（同4.2.8）
• 6.2.7 阳性克隆子的筛选
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 质粒DNA的提取
• 6.3.2 pUC19载体的酶切
• 6.3.3 亚克隆文库的构建
• 6.3.4 亚克隆文库的筛选
• 6.4 小结
• 第七章 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢