抗草鱼呼肠孤病毒药筛选细胞模型及分子检测方法的建立

论文摘要

草鱼（Ctenopharyngodon idellus）是我国重要的淡水养殖品种之一,占我国淡水鱼总产量的20%左右。草鱼以其生长快,饲料来源广及肉质鲜美等优点而深受广大养殖者与消费者欢迎。但是,由于草鱼易患多种疾病,而严重制约了草鱼养殖业的发展,特别是病毒性草鱼出血病,其发病时间长,流行区域广,死亡率高,造成了严重的经济损失。因而,草鱼出血病的防控技术研究一直是科研工作者长期的研究重点。免疫预防方法是预防草鱼出血病最为有效的方法。由于免疫预防技术离大规模生产应用尚有较大的距离,因此,寻找有效的药物来预防和治疗草鱼出血病对草鱼养殖业健康发展有重要意义。本研究以草鱼肾脏细胞系（CIK）和草鱼呼肠孤病毒（GCRV）为材料,进行抗病毒药物筛选研究。采用四噻唑盐染色法（MTT）方法进行了穿琥宁、板蓝根、黄芩、利巴韦林等药物抗GCRV的效果评价,建立了体外抗GCRV药物筛选的细胞模型。采用实时荧光定量PCR技术,直接检测病毒核酸量的变化评价药物抑制病毒的作用效果,建立了体外抗GCRV药物筛选的分子检测方法。MTT研究结果,在先给药后感染试验组,穿琥宁在阻断GCRV吸附和侵入细胞时效果最强,其次是利巴韦林和板蓝根,黄芩的阻断效果最弱,其治疗指数分别为810±47,108±13,35.28±8.35和18.08±3.76。在先感染后给药的试验中,穿琥宁利巴韦林和黄芩抑制GCRV增殖的作用显著,治疗指数分别为358±26,555±48和74.2±12.53,板蓝根抑制病毒增殖的作用不明显。在药物与病毒先共同孵育后感染的试验组中,利巴韦林对GCRV有一定直接杀灭作用,其治疗指数为102±16,黄芩、板蓝根和穿琥宁等的体外杀病毒效果不明显。在分子检测技术中,以GCRV-VP6蛋白编码基因为模板,采用实时荧光定量PCR技术,测定药物试验组与对照组病毒感染细胞后的GCRV-VP6编码基因的拷贝数,先感染后给药的研究结果表明,穿琥宁试验组检测不到GCRV-VP6编码基因,利巴韦林试验组中GCRV-VP6编码基因的相对拷贝数为病毒感染对照组的3.51±0.62%,板蓝根和黄芩试验组的GCRV-VP6相对拷贝数为对照组的25.34±2.48%和34.62±4.18%。分子检测结果与MTT法基本相符。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 草鱼出血病研究进展
• 1.1 草鱼出血病研究重要历史事件
• 1.2 草鱼出血病的预防及治疗
• 1.2.1 草鱼出血病的免疫预防
• 1.2.2 草鱼出血病的药物防治
• 2 草鱼呼肠孤病毒生物学特性
• 3 抗病毒药物研究进展
• 3.1 抗病毒药物的类型
• 3.1.1 抗病毒的化学合成药物
• 3.1.2 抗病毒中药制剂的研究
• 3.2 抗病毒药物筛选的模型研究
• 3.2.1 整体动物水平筛选模型
• 3.2.2 组织器官水平的筛选模型
• 3.2.3 细胞水平筛选模型
• 3.3 基于细胞模型的抗病毒药物筛选研究方法
• 3.3.1 细胞病变法（CPE）
• 3.3.2 蚀斑减数法（PRA）
• 3.3.3 噻唑蓝染料法（MTT）
• 3.3.4 病毒抗原的测定
• 3.3.5 病毒核酸量的分子检测
• 4 本论文研究的目的及意义
• 第二章 体外抗草鱼呼肠孤病毒药物筛选细胞模型的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 实验药物及提取
• 1.1.2 细胞及病毒材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 实验仪器与设备
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 病毒感染性及滴度的测定
• 1.4.2 药物对CIK细胞的毒性测定
• 1.4.3 药物筛选试验分组与抗病毒效果检测
• 1.5 统计学方法
• 2 实验结果
• 2.1 草鱼呼肠孤病毒对CIK细胞感染性的测定
• 2.2 药物对CIK细胞毒性的测定
• 2.3 先给药后感染试验组抑制病毒吸附侵入细胞的效果
• 2.4 先感染后给药试验组抑制病毒增殖的效果
• 2.5 病毒与药物共同孵育后感染试验组对病毒的直接杀灭作用
• 3. 讨论
• 第三章 抗草鱼呼肠孤病毒药物筛选荧光定量PCR检测方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 实验仪器与设备
• 1.4 引物设计
• 1.5 实验方法
• 1.5.1 病毒滴度的测定及药物对CIK细胞的毒性测定
• 1.5.2 药物抗病毒实验组处理
• 1.5.3 细胞总RNA提取
• 1.5.4 cDNA的成及PCR产物检测
• 1.5.5 实时荧光定量PCR
• 1.5.6 实时定量PCR扩增效率鉴定与溶解曲线的分析
• 1.5.7 实时定量PCR检测不同药物处理组中GCRV表达差异
• 2 结果
• 2.1 总RNA及实时荧光定量PCR结果检测
• 2.2 扩增效率及溶解曲线鉴定结果
• 2.3 不同药物处理组中GCRV的表达差异
• 3. 讨论
• 第四章 MTT法和MTS法在CIK细胞应用比较
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 细胞
• 1.2 主要试剂
• 1.3 实验仪器及设备
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 不同浓度细胞贴壁时间的测定
• 1.4.2 MTT和MTS试剂最适细胞接种数的确定
• 1.4.3 MTT和MTS最佳孵育时间的选择
• 2 结果与分析
• 2.1 不同浓度细胞贴壁时间的测定结果
• 2.2 最适细胞数量测定的测定结果
• 2.3 最适孵育时间的测定结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 在读期间发表论文及参加会议
• 致谢