2-5A和RNase L基因植物表达载体构建及对烟草和小麦的遗传转化

论文摘要

在哺乳动物体内存在着干扰素抗病毒系统,病毒的感染刺激干扰素的产生,在病毒感染的细胞中,干扰素又诱导免疫系统产生许多种活性蛋白抑制病毒的增殖,2-5A合成酶就是其中的一种。2-5合成酶被RNA病毒复制中间体dsRNA激活后催化nATP合成2-5A,2-5A激活RNase L降解病毒的RNA达到抗病毒的目的。 本文利用2-5A基因和RNase L基因,通过中间载体pJIT163将2-5A基因和RNase L基因克隆到双元植物表达载体pBINplus上,分别构建了2-5A基因的植物表达载体pBIN2-5A和RNase L基因的植物表达载体pBINRL。利用冻融直接转化法把pBIN2-5A和pBINRL分别转入土壤农杆菌LBA4404中,在农杆菌介导下,转化烟草“云烟87”,分别获得了转2-5A基因和RNase L基因以及同时转此两种基因的再生植株。对再生烟草植株进行了PCR检测,初步证明获得了转基因植株。用烟草花叶病毒蚕豆株系（TMV-B）和地黄花叶病毒（ReMV）进行攻毒试验,有关的抗病性结果正在调查中。 利用2-5A基因和RNase L基因的单子叶植物表达载体p2-5A-RNase L以及除草剂抗性基因表达载体pAHC,采用基因枪共转化法,对小麦“豫麦18”进行遗传转化,共转化了大约10000个外植体（盾片）,获得绿色转化株167株（T0）,经室内春化,温室栽种,获得了T0种子;对T1代再生植株进行了PCR筛选鉴定,初步鉴定出4个阳性株系,目前已收获了T1代种子。

论文目录

• 中文摘要
• 第一部分：文献综述
• Ⅰ 植物抗病毒基因工程研究进展
• 1.1 病毒来源基因介导的抗病性
• 1.1.1 外壳蛋白基因介导的抗病性
• 1.1.2 复制酶基因介导的抗病性
• 1.1.3 运动蛋白基因介导的抗病性
• 1.1.4 病毒反义RNA介导的抗病性
• 1.1.5 病毒卫星RNA介导的抗病性
• 1.1.6 核酶基因介导的抗病性
• 1.1.7 病毒弱毒株完整基因介导的抗病性
• 1.1.8 缺陷干扰分子介导的抗病性
• 1.1.9 其它病毒基因介导的抗性策略
• 1.2 非病毒来源基因介导的抗病性
• 1.2.1 利用植物抗病基因获得的抗病性
• 1.2.2 核糖体失活蛋白基因获得的抗病性
• 1.2.3 利用抗体基因获得的抗病性
• 1.3 RNA介导的抗病性
• Ⅱ 2—5A系统在植物抗病毒应用中的研究进展
• 2.1 2-5A系统基本特性
• 2.2 2-5A的作用途径
• 2.2.1 2-5A—RNaseL途径
• 2.2.2 受体途径
• 2.3 2-5A的生物活性和生物功能
• 2.3.1 抗病毒作用
• 2.3.2 抑制蛋白质等大分子的生物合成
• 2.3.3 影响某些酶活性
• 2.4 2-5A系统在植物抗病毒中的应用
• Ⅲ 展望
• Ⅳ 本论文研究的目的和意义
• 第二部分 2-5A基因和RNaseL基因植物表达载体构建及对烟草的遗传转化
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌株、质粒和烟草品种
• 1.1.2 酶和试剂
• 1.1.3 寡核苷酸引物
• 1.2 基本分子生物学方法
• 1.2.1 质粒的小量提取
• 1.2.2 质粒的大量提取
• 1.2.3 质粒的酶切和连接方法
• 1.2.4 DNA片段的回收纯化
• 1.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 1.2.6 转化大肠杆菌
• 1.2.7 重组质粒的单菌落直接快速鉴定法（Cracking）
• 1.2.8 植物表达载体的构建
• 1.2.9 植物表达载体向农杆菌的转化
• 1.2.10 外源基因对烟草的遗传转化
• 1.2.11 转基因烟草的PCR检测
• 1.2.12 转基因植株的抗病性鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 2-5A基因植物表达载体的构建
• 2.2 RNase L基因植物表达载体的构建
• 2.3 pBIN2-5A和pBINRL转化农杆菌LBA4404
• 2.4 农杆菌介导的外源基因向烟草中转化及转化植株的获得
• 2.5 转化植株的PCR检测
• 2.6 转基因植株的抗病性鉴定
• 3 小结
• 第三部分 2-5A基因、Rnase L基因植物表达载体对小麦的遗传转化
• 1 材料与方法
• 1.1 小麦材料
• 1.2 转化材料的准备
• 1.3 质粒提取
• 1.4 基因枪转化程序
• 1.4.1 金粉悬液的制备
• 1.4.2 微弹的制备
• 1.4.3 基因枪轰击
• 1.5 转化材料的培养及植株再生
• 1.6 幼苗春化及移栽
• 1.7 转基因植株的直接PCR检测
• 1.8 小麦叶片DNA PCR检测
• 2 结果与分析
• 2.1 转化愈伤组织的筛选与转基因植株的获得
• 2.2 T0代小麦的加代繁育
• 2.3 T1代再生小麦植株的PCR检测
• 3 小结
• 第四部分 结论与讨论
• 参考文献
• 英文摘要
• 附录