寡肽转运蛋白PepT2的原核表达与左旋多巴的修饰

论文摘要

hPepT2（Human Peptide Transporter，SLC15A2）是一种转运小肽的蛋白质载体，主要参与肾脏内二肽和三肽的重吸收。PepT2由729个氨基酸组成，含有12个跨膜结构域。除小肽外，一些类肽药物也是PepT2的底物。利用肽转运载体来促进药物或前体药物的吸收已成为生物药剂学的一个新研究领域。而应用基因表达技术可以大量表达外源蛋白质，是研究功能蛋白的热门手段。大肠杆菌表达系统是基因表达技术中常用的重要工具，但真核基因若含有较多原核细胞无法识别的稀有密码子，会使其在原核细胞中无法表达或表达中断，因此本研究通过在原核细胞表达体系中表达hPepT2片段蛋白，以研究这些片段蛋白的功能。采用PCR技术扩增了hPepT2的PepT2（1-174）和PepT2（624-729）编码区，将其分别重组到质粒pET30a（+）和pUC18上，获得了重组质粒pET30a（+）/hPepT2（1-174）和pUC18/hPepT2（624-729），将其转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，成功构建了pET30a（+）/hPepT2（1-174）/BL21（DE3）和pUC18/hPepT2（624-729）/BL21（DE3）表达体系。并利用SDS-PAGE法研究了ITPG诱导表达的条件，结果表明ITPG诱导表达4h时，片段蛋白的表达总量趋于稳定。采用Fmoc合成法合成了L-dopa-L-Tyr、L-dopa-L-His、L-dopa-L-Tyr-Tyr三种左旋多巴肽类衍生物，通过高效液相色谱技术对产物进行了分离和纯化，并进行了ESI-MS、1HNMR、13CNMR表征。利用紫外光谱法、荧光光谱法和琼脂糖凝胶电泳法研究了左旋多巴肽类衍生物与DNA的相互作用。左旋多巴肽类衍生物与ctDNA相互作用后，体系的紫外吸收光谱呈减色效应，推测是其与ctDNA之间发生了疏水相互作用或嵌插作用而引起的DNA分子超螺旋结构收缩所致；体系荧光光谱也呈减色效应，通过Stern-Volmer方程，得出三种衍生物对DNA-EB的猝灭常数均远大于小分子化合物与生物大分子之间最大扩散控制的碰撞常数2×1010L·mol-1·s-1，因此，可推测这三种左旋多巴肽类衍生物对DNA-EB的猝灭作用都是静态猝灭。而左旋多巴肽类衍生物与pUC18DNA相互作用后，pUC18的迁移速率变慢，可能是左旋多巴肽类衍生物与pUC18DNA发生嵌插作用形成复合物所致。实验结果表明，与L-dopa相比，左旋多巴肽类衍生物与DNA相互作用更强，且随着肽链的增长，化合物与DNA之间的相互作用增强。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 引言
• 1.1 蛋白质表达体系
• 1.1.1 原核表达体系
• 1.1.1.1 大肠杆菌表达体系
• 1.1.1.2 芽孢杆菌表达体系
• 1.1.1.3 链霉菌表达体系
• 1.1.2 真核表达体系
• 1.1.2.1 酵母表达体系
• 1.1.2.2 昆虫表达体系
• 1.1.2.3 哺乳动物表达体系
• 1.1.2.4 植物表达体系
• 1.2 左旋多巴及其衍生物
• 1.2.1 左旋多巴
• 1.2.2 左旋多巴的来源途径
• 1.2.3 左旋多巴的给药方法
• 1.2.4 左旋多巴的修饰
• 1.2.5 左旋多巴类化合物的其他应用
• 1.3 本课题的选题意义及主要内容
• 第二章 PEPT2（1-174）和 PEPT2（624-729）表达体系的构建及蛋白的表达
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要仪器设备
• 2.1.2 数据库及分析软件
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 常用试剂的配制
• 2.2 PET30A（+）/HPEPT2（1-174）/BL21（DE3）表达体系的构建
• 2.2.1 寡肽转运蛋白 HPEPT2 （1-174）基因的扩增
• 2.2.1.1 寡肽转运蛋白 hPepT2 （1-174）基因序列引物设计
• 2.2.1.2 hPepT2 （1-174）基因的 PCR 扩增
• 2.2.2 PMD18-T/HPEPT2 （1-174）/ DH5 重组克隆体系的构建[93]
• 2.2.2.1 CaCl2法制备 DH5 感受态细胞
• 2.2.2.2 pMD18-T/hPepT2 （1-174）重组克隆质粒的构建
• 2.2.2.3 pMD18-T/hPepT2 （1-174）重组克隆质粒的转化与筛选
• 2.2.2.4 pMD18-T/hPepT2 （1-174）重组克隆质粒的鉴定
• 2.2.3 PET30A（+）/HPEPT2 （1-174）/BL21（DE3）重组表达体系的构建
• 2.2.3.1 pET30a（+）载体质粒和 pMD18-T/hPepT2（1-174）重组质粒的制备
• 2.2.3.2 pMD18-T/hPepT2（1-174）和 pET30a（+）质粒的酶切
• 2.2.3.3 pET30a（+）/hPepT2 （1-174）重组表达质粒的构建
• 2.2.3.4 pET30a（+）/hPepT2 （1-174）重组表达质粒的转化
• 2.2.3.5 pET30a（+）/hPepT2 （1-174）重组表达质粒的鉴定
• 2.2.4 重组表达质粒 PET30A（+）/HPEPT2 （1-174）的诱导表达
• 2.2.4.1 pET30a（+）/hPepT2 （1-174）的诱导表达
• 2.2.4.2 表达产物的 SDS-PAGE 检测
• 2.3 PUC18/PEPT2（624-729）/BL21（DE3）表达体系的构建
• 2.3.1 PCR 扩增 PEPT2（624-729）基因片段
• 2.3.2 PUC18/PEPT2（624-729）重组质粒的构建与鉴定
• 2.3.2.1 pUC18 质粒和 PCR 产物 PepT2（624-729）的双酶切
• 2.3.2.2 pUC18/hPepT2（624-729）重组质粒的构建与转化
• 2.3.2.3 pUC18/hPepT2（624-729）重组质粒的鉴定
• 2.3.3 PUC18/HPEPT2（624-729）重组质粒的诱导表达
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 目的基因的 PCR
• 2.4.2 PET30A（+）/HPEPT2（1-174）/BL21（DE3）表达体系的构建
• 2.4.2.1 pET30a（+）载体质粒的制备
• 2.4.2.2 感受态细胞的制备
• 2.4.2.3 pMD18-T/hPepT2（1-174）重组克隆质粒的构建及转化
• 2.4.2.4 pMD18-T/hPepT2（1-174）重组克隆质粒的 PCR 鉴定和酶切鉴定
• 2.4.2.5 pET30a（+）/hPepT2（1-174）重组表达质粒的构建及鉴定
• 2.4.2.6 pET30a（+）/hPepT2（1-174）重组表达质粒的序列分析
• 2.4.3 PUC18/HPEPT2（624-729）/BL21（DE3）重组表达体系的构建
• 2.4.3.1 pUC18/hPepT2（624-729） 重组质粒的构建及鉴定
• 2.4.3.2 pUC18/hPepT2（624-729） 重组质粒的序列分析
• 2.4.4 重组质粒的诱导表达
• 2.5 本章小结
• 第三章 左旋多巴肽类化合物的合成及其与 DNA 的相互作用
• 3.1 实验材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.1.1 实验仪器
• 3.1.1.2 实验试剂
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 L-dopa-L-Tyr 的合成
• 3.1.2.2 L-dopa-L-His 的合成
• 3.1.2.3 L-dopa-L-Tyr-L-Tyr 的合成
• 3.1.2.4 高效液相色谱分离纯化
• 3.1.2.5 质谱分析及核磁分析
• 3.1.2.6 溶液的配制
• 3.1.2.7 紫外光谱法研究左旋多巴及其修饰物与 ctDNA 的相互作用
• 3.1.2.8 荧光光谱法研究左旋多巴及其修饰物与 ctDNA 的相互作用
• 3.1.2.9 琼脂糖凝胶电泳法研究左旋多巴及其修饰物与 pUC18 DNA 的相互作用
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 L-DOPA-L-TYR 的合成及其与 DNA 相互作用研究
• 3.2.1.1 L-dopa-L-Tyr 的液相色谱纯化及质谱检测
• 3.2.1.2 L-dopa-L-Tyr 的核磁表征
• 3.2.1.3 紫外光谱法研究 L-dopa 及 L-dopa-L-Tyr 与 ctDNA 的相互作用
• 3.2.1.4 荧光光谱法研究 L-dopa 及 L-dopa-L-Tyr 与 ctDNA 的相互作用
• 3.2.1.5 凝胶电泳法研究 L-dopa-L-Tyr 与 pUC18 DNA 的相互作用[100]
• 3.2.2 L-DOPA-L-HIS 的合成及其与 DNA 相互作用研究
• 3.2.2.1 L-dopa-L-His 液相色谱纯化及质谱检测
• 3.2.2.2 L-dopa-L-His 的核磁表征
• 3.2.2.3 紫外光谱法研究 L-dopa-L-His 与 ctDNA 的相互作用
• 3.2.2.4 荧光光谱法研究 L-dopa-L-His 与 ctDNA 的相互作用
• 3.2.2.5 凝胶电泳法研究 L-dopa-L-His 与 pUC18 DNA 的相互作用
• 3.2.3 L-DOPA-L-TYR-L-TYR 的合成及其与 DNA 相互作用研究
• 3.2.3.1 L-dopa-L-Tyr-L-Tyr 液相色谱纯化及质谱检测
• 3.2.3.2 L-dopa-L-Tyr-L-Tyr 的核磁表征
• 3.2.3.3 紫外光谱法研究 L-dopa-L-Tyr-Tyr 与 ctDNA 的相互作用
• 3.2.3.4 荧光光谱法研究 L-dopa-L-Tyr-Tyr 与 ctDNA 的相互作用
• 3.2.3.5 凝胶电泳法研究 L-dopa-L-Tyr-Tyr 与 pUC18 DNA 的相互作用
• 3.3 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 个人简历