天然酚类和蛋白质与ONOO-相互作用的体外研究

论文摘要

过氧化亚硝基（ONOO-）是由机体内一氧化氮（NO）与超氧阴离子（·O2-）合成的一类氮自由基,可引发机体的损伤。清除过氧化亚硝基,抑制其对蛋白质的硝基化修饰是目前国际研究的热点之一。本文采用HPLC和质谱分析,研究了几种天然酚类对过氧化亚硝基的清除活性与构效关系;采用HPLC/MS/MS、结合Bioworks肽段检索软件,研究了过氧化亚硝基对干扰素和白蛋白的损伤。咖啡酸及其衍生物是水溶性抗氧化剂,具有明显清除ONOO-的活性,清除能力由高到低依次为:丹酚酸B（27.55±0.13μM）>迷迭香酸（37.68±0.22μM）>咖啡酸（39.60±0.41μM）>阿魏酸（45.05±0.57μM）>丹参素钠（51.51±1.02μM）>trolox（85.44±1.68μM）。4-酚羟基是活性必需基团,同时3, 4-邻二酚羟基、丙烯酸侧链是活性增强基团,且3, 4-邻二酚羟基数目与活性成正比。白藜芦醇和虎杖苷是一类脂溶性抗氧化剂,它们清除ONOO-能力由高到低依次为:白藜芦醇（48.34±0.97μM）>虎杖苷（74.69±1.49μM）>trolox（105.40±1.16μM）。质谱分析表明,阿魏酸、白藜芦醇清除ONOO-作用是通过硝化反应机理。ONOO-能损伤白蛋白和干扰素等蛋白质,损伤程度与ONOO-浓度成正比。ONOO-对人干扰素损伤位点在A螺旋上Met16发生氧化,近E螺旋上Tyr135发生硝化,还有一个位于E螺旋上的疑似硝化位点W140。这几个位点氧化和硝基化修饰将对干扰素活性产生影响。ONOO-诱发机体内蛋白的氧化/硝化修饰而活性降低或失活,而天然酚类化合物是一类良好的ONOO-清除剂。本文的结果为进一步研究ONOO-清除剂类药物,保护机体免受自由基损伤奠定一定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 过氧化亚硝基
• 1.1.1 过氧化亚硝基
• 1.1.2 过氧化亚硝基合成途径
• 1.1.3 过氧化亚硝基的损伤作用
• 1.1.4 RNS/ROS/HOCl生物损伤体系
• -的机理'>1.2 天然酚类抗氧化剂清除ONOO^-的机理
• -直接作用的硝化位点取向'>1.2.1 酚类化合物与ONOO^-直接作用的硝化位点取向
• -的作用机理'>1.2.2 酚类化合物清除ONOO^-的作用机理
• -活性-结构关系'>1.2.3 量子化学法研究酚类清除ONOO^-活性-结构关系
• 1.3 酚类抗氧化剂
• 1.3.1 咖啡酸类化合物
• 1.3.2 白藜芦醇与虎杖苷
• 1.4 重组干扰素
• 1.4.1 干扰素分类以及IFN-α2b结构特点
• 1.4.2 干扰素生物学活性
• 1.5 本文主要内容和研究意义
• -的活性和构效关系'>第二章 咖啡酸类清除ONOO^-的活性和构效关系
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要仪器
• -的合成'>2.1.3 ONOO^-的合成
• -的鉴定与分析'>2.1.4 ONOO^-的鉴定与分析
• -的作用'>2.1.5 酪氨酸与ONOO^-的作用
• 2.1.6 3-硝基酪氨酸标准曲线
• -的活性'>2.1.7 高效液相法测抗氧化剂清除ONOO^-的活性
• 50 的计算'>2.1.8 IC₅₀的计算
• -的直接作用'>2.1.9 咖啡酸类与ONOO^-的直接作用
• -作用产物的质谱分析'>2.1.10 阿魏酸与ONOO^-作用产物的质谱分析
• 2.1.11 统计分析
• 2.2 结果与讨论
• -的紫外光谱特性'>2.2.1 ONOO^-的紫外光谱特性
• 2.2.2 3-硝基酪氨酸的紫外光谱特性
• 2.2.3 3-硝基酪氨酸的标准曲线
• -的活性'>2.2.4 咖啡酸类化合物清除ONOO^-的活性
• -的S曲线拟和与IC₅₀值'>2.2.5 咖啡酸类化合物清除ONOO^-的S曲线拟和与IC₅₀值
• -作用产物的紫外光谱特性'>2.2.6 咖啡酸类化合物与ONOO^-作用产物的紫外光谱特性
• -作用后硝化产物的质谱特性'>2.2.7 阿魏酸与ONOO^-作用后硝化产物的质谱特性
• 2.3 小结
• -的活性'>第三章 白藜芦醇与虎杖苷清除ONOO^-的活性
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 主要仪器
• -的合成'>3.1.3 ONOO^-的合成
• -的清除作用'>3.1.4 金属离子对ONOO^-的清除作用
• -的清除作用'>3.1.5 有机溶剂对ONOO^-的清除作用
• 3.1.6 紫外分光法测定tyrosine损伤产物3-NT
• 3.1.7 荧光分光法测定tyrosine损伤产物dityrosine
• -的活性'>3.1.8 高效液相法测白藜芦醇/虎杖苷清除ONOO^-的活性
• 50 计算'>3.1.9 IC₅₀计算
• -的直接作用'>3.1.10 白藜芦醇/虎杖苷与ONOO^-的直接作用
• -作用产物的质谱分析'>3.1.11 白藜芦醇与ONOO^-作用产物的质谱分析
• 3.1.12 统计分析
• 3.2 结果与讨论
• -损伤tyrosine的影响'>3.2.1 金属离子对ONOO^-损伤tyrosine的影响
• -损伤tyrosine的影响'>3.2.2 有机溶剂对ONOO^-损伤tyrosine的影响
• -损伤tyrosine生成3-NT/dityrosine的浓度效应'>3.2.3 ONOO^-损伤tyrosine生成3-NT/dityrosine的浓度效应
• -的活性'>3.2.4 白藜芦醇/虎杖苷清除ONOO^-的活性
• -的S曲线拟和与IC₅₀值'>3.2.5 白藜芦醇ONOO^-的S曲线拟和与IC₅₀值
• 直接作用的紫外光谱特性'>3.2.6 白藜芦醇/虎杖苷与ONOO^直接作用的紫外光谱特性
• -生成硝化产物的质谱特性'>3.2.7 白藜芦醇与ONOO^-生成硝化产物的质谱特性
• 3.3 小结
• -作用的氨基酸损伤位点'>第四章 人干扰素与ONOO^-作用的氨基酸损伤位点
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 实验中所用溶液的配制
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 蛋白样品制备
• 4.1.5 肽段的色谱分离及质谱检测
• 4.1.6 蛋白肽段的鉴定与分析
• 4.2 结果与讨论
• -损伤蛋白样的HPLC-MS及HPLC-MS/MS图谱'>4.2.1 ONOO^-损伤蛋白样的HPLC-MS及HPLC-MS/MS图谱
• -引发的IFN损伤的氨基酸位点'>4.2.2 ONOO^-引发的IFN损伤的氨基酸位点
• -引发的发生氧化/硝化修饰肽段的分析'>4.2.3 ONOO^-引发的发生氧化/硝化修饰肽段的分析
• 4.3 小结
• -与白蛋白作用的初步研究'>第五章 ONOO^-与白蛋白作用的初步研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 主要试剂
• 5.1.2 实验中所用溶液的配制
• 5.1.3 主要仪器
• 5.1.4 BSA的硝化损伤
• 5.1.5 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与图像分析
• 5.1.6 用Sephadex G75 分离BSA
• 5.1.7 统计分析
• 5.2 结果与讨论
• -引发的BSA硝化损伤'>5.2.1 ONOO^-引发的BSA硝化损伤
• 5.2.2 BSA的硝化损伤
• -引起蛋白硝化的影响'>5.2.3 阿魏酸对ONOO^-引起蛋白硝化的影响
• 5.3 小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 致谢