Delftia tsuruhatensis AD9苯胺降解基因表达调控研究

论文摘要

Delftia tsuruhatensis AD9能以苯胺或邻苯二酚为唯一碳源和氮源进行生长。与目前已报道的其它苯胺降解菌比较,该菌表现出较高的苯胺降解速率和较强的苯胺耐受能力。本研究采用基因敲除、lacZ融合表达、凝胶阻滞实验以及荧光定量PCR等方法,开展了D. tsuruhatensis AD9苯胺降解调控蛋白TadR的功能鉴定和tad基因簇表达调控机制研究。D. tsuruhatensis AD9苯胺降解基因簇组成结构分析表明,苯胺降解基因分布在三个操纵子。氨基酸序列分析表明,D. tsuruhatensis AD9的TadR属于LysR-type家族的调控蛋白,与苯胺降解菌Pseudomonas putida UCC22的TdnR有97.6%的同源性;OrfS同样属于LysR-type家族调控蛋白,与苯酚降解菌Comamonas testosteroni TA441的AphT氨基酸序列有69%的同源性。苯胺降解基因簇结构基因的表达可能受到这两个LysR-type蛋白的调控。为了验证苯胺降解基因簇的表达调控,本工作构建了tadR的缺失插入突变株。tadR突变株不能以苯胺为唯一碳源生长,但可以利用邻苯二酚作为唯一碳源进行生长,互补菌株能以苯胺为唯一碳源生长,说明tadR是苯胺降解基因簇中一个重要的基因。凝胶阻滞实验初步证明TadR蛋白在体外能和苯胺降解基因簇的tadQ启动子结合。利用RT-PCR和实时荧光定量PCR对比分析野生型AD9和突变株AD91苯胺降解基因表达情况的差异,结果表明在苯胺存在情况下,tadR基因正调控第一个操纵子的表达,同时也调控orfS基因的表达。为研究基因的表达情况,构建了tadQ::lacZ和tadD2::lacZ的融合表达载体,并分别导入到野生型AD9和突变株AD91中。β-半乳糖苷酶分析表明,苯胺降解基因组成两个操纵子:tadQTA1A2BRD1C1操纵子编码苯胺双加氧酶和邻苯二酚2,3-双加氧酶,tadD2C2EFGIJKL操纵子编码邻苯二酚间位降解酶系。tadQ启动子的表达在TadR蛋白存在情况下受苯胺诱导。tadD2启动子受到邻苯二酚,粘糠酸和2-羟基苯胺的诱导。诱导谱结果显示,氯代苯胺对该tadQ启动子也有诱导作用,特别是4-氯苯胺的诱导作用比苯胺更为明显。HPLC分析表明,AD9不能降解2-氯苯胺和3-氯苯胺,在生长的后期可以降解微量的4-氯苯胺。邻苯二酚2,3-双加氧酶酶活分析表明,TadC1在苯胺降解基因簇中起主要作用,TadC2对邻苯二酚的降解可能起补偿作用。PtadQ启动子5’端缺失试验结果表明,1到-148bp的片段是β-半乳糖苷酶表达所必需的,进一步删除导致β-半乳糖苷酶活性的完全丧失,-89到-148bp之间的反向重复序列在启动子转录激活中起重要作用。PtadD2上游反向重复序列IR1对启动子活性表达必不可少。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 微生物中芳香族化合物降解基因簇转录调控的研究进展
• 1.1 微生物中苯胺降解基因簇的研究进展
• 1.1.1 微生物中苯胺降解基因簇代谢途径的研究
• 1.1.2 微生物苯胺降解基因簇的克隆
• 1.2 微生物中苯胺代谢表达调控的研究
• 1.2.1 基因水平上苯胺降解基因簇的表达调控研究
• 1.2.2 蛋白质组水平研究苯胺的代谢调控
• 1.2.3 利用代谢工程研究苯胺降解基因簇的表达调控
• 1.3 微生物中芳香组化合物降解基因簇转录调控的研究进展
• 1.3.1 LysR-type转录调节蛋白
• 1.3.2 IclR-type调控蛋白
• 1.3.3 AraC-type调控蛋白
• 1.3.4 XylR/NtrC-type调控蛋白
• 1.3.5 GntR-type调控蛋白
• 1.3.6 TetR-, MarM-和FNR-type调控蛋白
• 1.3.7 双成分信号家族调控蛋白
• 1.3.8 细胞生理水平的高级调控
• 1.4 提高芳烃化合物降解能力的策略
• 1.4.1 通过代谢工程构建新的降解途径
• 1.4.2 利用蛋白质工程提高降解效率
• 1.4.3 提高降解菌的环境适应性
• 1.4.4 提高污染物的生物可利用度
• 1.4.5 生物安全性
• 1.5 邻苯二酚2,3-双加氧酶的研究进展
• 1.5.1 邻苯二酚2,3-双加氧酶结构
• 1.5.2 邻苯二酚2,3-双加氧酶的反应机制
• 1.5.3 邻苯二酚2,3-双加氧酶在不同菌属中的功能
• 1.5.4 苯胺降解基因簇中邻苯二酚2,3-双加氧酶的功能
• 1.6 本论文的立题依据
• 第二章 LysR-type调控蛋白TadR的功能鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 酶，试剂和试剂盒
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 抗生素
• 2.2 方法
• 2.2.1 质粒DNA的提取
• 2.2.2 基因组DNA提取
• 2.2.3 PCR扩增及纯化
• 2.2.4 酶切及连接反应
• 2.2.5 高效率转化感受态细胞的制备、转化
• 2.2.6 重组子的筛选与鉴定
• 2.2.7 三亲接合
• 2.2.8 苯胺的测定采用偶氮比色法
• 2.2.9 β-半乳糖苷酶活性分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 TadR蛋白序列分析
• 2.3.2 调控蛋白TadR突变株的构建过程
• 2.3.3 tadR互补菌株的构建
• 2.3.4 野生型AD9、突变株AD91、互补菌株AD94 的特征及生理生化测定
• 2.3.5 tadQ启动子验证载体的构建
• 2.3.6 ONPG法定量测定结合子的β-半乳糖苷酶活性
• 2.4 讨论
• 第三章 苯胺降解基因簇tad操纵子的分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 酶，试剂及主要仪器
• 3.1.3 培养基与抗生素
• 3.1.4 引物
• 3.2 方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 AD9 苯胺降解基因簇中tadD2 的诱导型启动子的预测
• 3.3.2 tadD2 启动子验证载体的构建
• 3.3.3 tadD2 启动子的活性和诱导谱分析
• 3.3.4 tadD2 启动子结构分析
• 3.3.5 tadQ启动子的诱导谱分析
• 3.3.6 tadQ启动子结构分析
• 3.3.7 OrfS的结构分析
• 3.3.8 OrfS的系谱分析
• 3.4 讨论
• 第四章 TadR调控蛋白在苯胺降解基因簇中的功能研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株和质粒
• 4.1.2 酶，试剂，试剂盒及主要仪器
• 4.1.3 培养基与抗生素
• 4.1.4 PCR引物
• 4.1.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳用溶液及缓冲液
• 4.1.6 纯化His-Tag融合蛋白的NTA缓冲液的配制
• 4.1.7 凝胶阻滞试剂配置
• 4.2 原理
• 4.2.1 凝胶阻滞实验原理
• 4.2.2 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）原理
• 4.3 方法
• 4.3.1 SDS-PAGE蛋白电泳操作
• 4.3.2 融合蛋白的诱导表达
• 4.3.3 蛋白表达形式的分析
• 4.3.4 TadR-His融合蛋白的纯化
• 4.3.5 总蛋白的测定
• 4.3.6 凝胶阻滞实验
• 4.3.7 反转录样品的处理
• 4.3.8 细菌总RNA的提取
• 4.3.9 第一链cDNA的反转录合成
• 4.3.10 PCR反应体系及反应条件
• 4.3.11 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的实验过程
• 4.3.12 数据分析
• 4.3.13 其它的实验方法
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 原核表达载体pETR的构建
• 4.4.2 融合蛋白TadR的表达与分析
• 4.4.3 融合蛋白TadR的纯化与分析
• 4.4.4 探针的标记结果
• 4.4.5 TadR蛋白与探针的结合实验
• 4.4.6 RNA的提取
• 4.4.7 RT-PCR鉴定AD9 和AD91 中苯胺降解基因簇中各基因转录的表达
• 4.4.8 实时荧光定量PCR验证苯胺降解基因簇基因的表达情况
• 4.5 讨论
• 第五章 AD9 降解氯代苯胺特征及TadC1, TadC2 功能验证
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌株和质粒
• 5.1.2 酶，试剂及主要仪器
• 5.1.3 培养基与抗生素
• 5.1.4 引物
• 5.2 方法
• 5.2.1 代谢产物的检测
• 5.2.2 序列分析及蛋白结构预测
• 5.2.3 邻苯二酚含量的测定（p-aminophenol方法）
• 5.2.4 邻苯二酚2,3-双加氧酶的测定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 AD9 降解特性分析
• 5.3.2 tadC1 和tadC2 基因的序列分析及蛋白结构比较
• 5.3.3 原核表达载体pETC1 和pETC2 的构建
• 5.3.4 原核表达载体pETC1 和pETC2 表达产物的SDS-PAGE分析
• 5.3.5 邻苯二酚2,3-双加氧酶在大肠杆菌中的表达
• 5.3.6 邻苯二酚2,3-双加氧酶酶活测定
• 5.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历