论文摘要
艾滋病（AIDS）从发现至今已有25年,但它在全球所引起的广泛流行,已使4000多万人受到感染,2200多万人失去了生命。目前全球人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者总数达到4200万人,如果不扩大采取有效预防措施,在2010年前,世界126个中、低收入国家还将有4500万人感染HIV,其中40%在亚洲和太平洋地区。中国和印度这两个人口最多的国家HIV/AIDS也在蔓延:中国HIV感染者总数已近100万人,如果不能有效控制,今后10年这一数字可能会成倍增加;印度HIV感染者更是达到了397万,而且今后仍有可能大幅增长。目前应用联合高效的抗逆转录病毒疗法（HAART）,已在很大程度上降低了HIV-1感染的发病率和死亡率。三类主要的药物——核苷类逆转录酶抑制剂（NRTI）、非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTI）和蛋白酶抑制剂（PI）,它们定向作用于逆转录酶和蛋白酶。尽管这些药物可以有效地抑制病毒感染,但由于抗药性HIV-1的出现,以及抗逆转录病毒治疗中出现的许多不良反应,目前仍迫切需要研发新的治疗药物和方法。在各种新的正在研发的抗HIV药物中,趋化因子受体拮抗剂最令人注目,这不仅因为它能够有效地对抗逆转录病毒活性,还能靶向性阻断HIV-1入侵细胞的关键蛋白——CD4+T细胞和巨噬细胞表面的微孔蛋白（即HIV-1辅受体）,可以阻断其与病毒包膜糖蛋白（gp120）间的相互作用,从而发挥抗HIV-1感染的治疗作用。因此,关于HIV-1辅受体及其配体——趋化因子RANTES、MIP-1和SDF-1的研究,成为抗HIV-1感染基因治疗基础研究的热点内容。美国Chen SY领导的科研小组研究表明:α类趋化因子SDF-1的细胞内表达可以从表型上剔除CXCR4,从而阻断T嗜性HIV-1的感染;而β类趋化因子RANTES和MIP-1的细胞内表达可以从表型上剔除CCR5,从而阻断M嗜性HIV-1的感染。我科白雪帆教授、张颖博士等在单一配基表达阻断HIV-1研究的基础上,采用细胞内趋化因子（intrakine）技术构建含有HIV-1两类辅受体的配体——趋化因子RANTES和SDF-1的双表达真核载体和逆转录病毒载体;将表达载体转染各类细胞,观察目的基因的表达及表达产物在细胞内与辅受体的结合;病毒感染实验检测辅受体表型剔除对HIV-1膜蛋白诱导合胞体形成、假病毒HIV-CAT的表达及病毒p24抗原活性,观察了淋巴细胞辅受体的表型剔除对HIV-1病毒感染的阻断作用。在基础和应用研究中,作为基因转移的一种新的有效和多用途的工具,慢病毒载体在基因治疗领域展示出可喜的前景。慢病毒载体能转导非分裂细胞,并能维持转基因持久和长期表达。许多细胞类型,如脑、肝、肌肉和造血干细胞,已经成功地转导了携带多种基因的慢病毒载体。同样,慢病毒载体能设计成可表达治疗性抗HIV-1的基因,特异性地靶向于病毒复制的不同阶段。为此,我们应用分子生物学技术构建了含CC-细胞内趋化因子（CC-intrakine,RANTES-K）和CXC-细胞内趋化因子（CXC-intrakine,SDF-K）的慢病毒表达质粒pLenti6/V5-R-K和pLenti6/V5-S-K,并在293FT细胞中建立了慢病毒株,转导CD34+人造血干细胞（hHSC）后,观测了细胞中RANTES和SDF-1蛋白的表达情况及感染HIV-1病毒液后p24抗原分泌水平,以观察CD34+hHSC辅受体的表型剔除对HIV-1病毒感染的阻断作用。实验结果如下:1、酶切和测序表明HIV-1辅受体CCR5、CXCR4的配体RANTES和SDF-1的慢病毒表达质粒pLenti6/V5-R-K和pLenti6/V5-S-K符合其物理图谱,构建是成功的。2、在293FT细胞中分别制备了包含慢病毒表达质粒pLenti6/V5-R-K和pLenti6/V5-S-K的慢病毒株,滴度分别为8.67×105转导单位（TU）/ml和8.56×105转导单位（TU）/ml,此慢病毒株可用于后续研究。3、将慢病毒株分别转染HeLa细胞和免疫磁珠法分离人脐带血得到的CD34+hHSC（流式细胞仪分析纯度为96.8%）,间接免疫荧光证实RANTES和SDF-1蛋白可以表达于人宫颈癌HeLa细胞系和CD34+hHSC内。4、慢病毒株转染的CD34+hHSC在感染HIV-1 DP1/27病毒液后第4、7和10d皆可发现显著的p24抗原表达下降（P<0.05）,分别减少了51%、58%、60%（包含慢病毒表达质粒pLenti6/V5-R-K的慢病毒株）和50%、57%、58%（包含慢病毒表达质粒pLenti6/V5-S-K的慢病毒株）,表明慢病毒表达质粒pLenti6/V5-R-K和pLenti6/V5-S-K转染具有阻断HIV-1病毒复制的作用。综上所述,本文采用细胞内趋化因子技术进行HIV-1两类主要辅受体CCR5和CXCR4的配体——RANTES和SDF-1的慢病毒质粒表达,使两类HIV-1辅受体被阻断,并转染到CD34+人造血干细胞（hHSC）中,试图为将来回输基因修饰的hHSC进而永久抑制HIV-1复制的抗HIV-1基因治疗寻求一个新的突破点。
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