有/无共培养条件下前列腺上皮、间质细胞差异表达基因筛选及表达研究

论文摘要

背景及目的良性前列腺增生（BPH）是一种以下尿路症状为表现的老年男性常见疾病。关于其发病机制有多种学说,公认的学说有雄激素、雌激素、生长因子、神经递质、凋亡、上皮-间质细胞相互作用等。但是其具体的分子机制仍不明确。近年来上皮-间质细胞相互作用学说日益受到关注,大量的研究表明上皮细胞-间质细胞之间存在着复杂的相互作用。前列腺间质细胞和上皮细胞分泌的生长因子,通过旁分泌的形式相互影响与调节上皮和间质细胞的分化和生长。这些生长因子又受到雌雄激素及其他的分泌因子调控,构成上皮-间质相互作用网络。这一调控机制对维持细胞的分化、生长、凋亡平衡起重要作用。这一调控网络的异常,可能会导致细胞的过度增殖表现为前列腺增生或肿瘤。有研究显示与正常前列腺间质细胞共培养的前列腺肿瘤细胞系生长受到抑制。部分增生明显的前列腺组织中可以发现微小肿瘤以及腺瘤样增生的病变,提示前列腺增生与前列腺癌的发生、进展可能有某些类似的机制。Bayne通过对前列腺上皮-成纤维细胞共培养模型研究证实:共培养条件下前列腺上皮细胞可以恢复5α还原酶的表达及PSA的分泌,认为前列腺细胞共培养模型可以最大程度的模拟细胞在体内的生长状态,因此共培养是一种很好的探讨前列腺疾病及其发病的分子机制和细胞特性的体外研究方法。近年,大量研究证实,前列腺上皮细胞和间质细胞之间存在一种相互依存、相互调节的关系,这种双向的作用使得前列腺细胞生长、凋亡处于一种动态平衡;其中的个别或一些因素改变可能是导致前列腺疾病发生的原因。这些差异表达的基因的表达产物可能是上皮-间质细胞相互作用的信号分子。这些基因的确定以及进一步功能研究,可能为探讨前列腺增生乃至前列腺癌的发病机制提供线索。目前对于上皮-间质细胞相互作用关系的研究多限于有限的几个基因,尚无共培养与非共培养条件下系统的筛选差异表达基因的研究,本课题试图建立良性增生的前列腺上皮细胞-成纤维细胞共培养模型,与分离培养的上皮和间质细胞对照,筛选差异表达基因。方法1.取良性增生前列腺组织剪碎,胶原酶消化后沉降法分离前列腺上皮和成纤维细胞进行原代培养,传代培养纯化后,建立共培养模型。以单独培养的上皮和成纤维细胞作为对照。2.差异显示逆转录PCR,筛选差异表达片段。切下差异表达片段,回收。再扩增,克隆、测序,用GeneBank数据库中BLAST软件比对,进行同源性分析,确定差异表达的片段代表的基因,反向Northern杂交验证。3.选取部分感兴趣基因,重复半定量RT-PCR验证差异表达基因。针对我们最感兴趣的KLK7基因,收取细胞培养上清液以及细胞浆蛋白提取液,进行蛋白水平验证。4.用半定量RT-PCR、免疫组织化学、蛋白印迹方法探讨KLK7在不同类型前列腺组织中表达情况。5.用半定量RT-PCR、免疫组织化学、蛋白印迹方法探讨KLK7抑制剂SLPI在不同类型前列腺组织中表达情况。结果1.成功分离前列腺上皮细胞、成纤维细胞,并建立共培养模型。2.通过差异显示RT-PCR筛选出110个差异表达片段,经反向Northern证实并成功测序的有68个,其中上皮细胞中差异表达片段43个（共培养条件下37个片段上调,6个片段下调。）,成纤维细胞中差异表达片段25个（6个片段表达上调,19个片段表达下调。）。3.通过半定量RT-PCR进一步证实差异表达基因,证实了5个差异表达基因:共培养条件下上皮细胞中KLK7基因上调表达;共培养成纤维细胞中S100A11,3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白,周期蛋白I,Latexin下调。4.mRNA水平研究显示KLK7与SLPI在前列腺癌中表达同步下调,KLK7与SLPI表达在前列腺增生和正常前列腺组织中表达差异无统计学意义。5.通过免疫组化研究显示,KLK7与SLPI在前列腺癌中表达同步下调,KLK7与SLPI表达在前列腺增生和正常前列腺组织中表达差异无统计学意义。KLK7与SLPI在前列腺癌组织中表达水平与Gleason分级呈负相关。结论这些差异表达基因可能是前列腺上皮与成间质细胞之间的信号分子,参与上皮-间质细胞间的相互调控。KLK7与其抑制剂在前列腺癌组织中表达下调,表达水平与Gleason分级负相关,提示这两个基因在前列腺细胞的生长调控中可能起重要作用,以及可能在前列腺癌的进展中扮演一定角色。这些差异表达的基因功能有待进一步探讨。

论文目录

• 英文缩略词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 实验技术路线
• 第一部分 前列腺生理及前列腺增生、前列腺癌分子机制（综述）
• 1 前列腺解剖结构及生理
• 2 前列腺的发生生理
• 3 前列腺细胞类型
• 3.1 上皮细胞
• 3.2 神经内分泌细胞
• 3.3 暂时增殖细胞
• 3.4 基底/干细胞
• 3.5 间质细胞和组织基质
• 4 前列腺生长与内分泌调节
• 4.1 雄激素
• 4.2 雌激素
• 4.3 雄激素结合蛋白
• 4.4 催乳素
• 5 类固醇激素和生长因子对前列腺生长的调控
• 第二部分 有/无共培养条件下良性增生前列腺上皮细胞、间质细胞差异表达基因的筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 主要材料
• 1.1.1 主要仪器
• 1.1.2 标本
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 溶液的配制
• 1.2 实验方法与步骤
• 1.2.1 细胞培养
• 1.2.2 细胞鉴定
• 1.2.3 前列腺上皮-间质细胞共培养
• 1.2.4 总RNA提取
• 1.2.5 RNA准备
• 1.2.6 mRNA差异显示
• 1.2.7 PCR产物克隆
• 1.2.8 测序
• 1.2.9 核酸序列分析
• 1.2.10 反向northern杂交
• 1.2.11 半定量RT-PCR验证差异表达基因
• 1.2.12 蛋白印迹分析共培养模型中KLK7蛋白表达水平
• 2 结果
• 2.1 上皮和成纤维细胞培养
• 2.2 形态学观察结果
• 2.3 总RNA电泳结果
• 2.4 PSA mRNA表达
• 2.5 PSA及Desmin蛋白染色鉴定前列腺上皮、成纤维细胞
• 2.6 差异显示RT-PCR
• 2.7 反向northern blot
• 2.8 克隆、测序、比对分析
• 2.9 半定量RT-PCR验证
• 2.10 蛋白印迹分析KLK7蛋白表达
• 3 讨论
• 3.1 良性前列腺增生发病机制
• 3.2 共培养
• 3.3 差异显示PCR
• 3.4 差异表达基因
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 组织激肽释放酶基因7（KLK7）及其抑制剂分泌性白细胞蛋白酶抑制剂（SLPI）在良性前列腺组织、前列腺癌组织中表达
• 1 材料与方法
• 1.1 主要材料
• 1.1.1 主要仪器
• 1.1.2 标本
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 溶液的配制
• 1.2 实验方法与步骤
• 1.2.1 细胞培养
• 1.2.2 总RNA提取
• 1.2.3 逆转录
• 1.2.4 PCR
• 1.2.5 蛋白印迹分析
• 1.2.6 免疫组织化学研究KLK7与SLPI在不同类型前列腺组织中表达情况
• 2 结果
• 2.1 细胞培养
• 2.2 RT-PCR检测KLK7和SLPI核酸水平表达
• 2.2.1 KLK7和SLPI mRNA表达
• 2.2.2 KLK7和SLPI RT-PCR产物测序
• 2.3 蛋白印迹实验分析hK7和SLPI蛋白水平表达
• 2.4 免疫组织化学研究
• 3 讨论
• 3.1 hK7功能及其与肿瘤的关系
• 3.2 SLPI功能及其与肿瘤的关系
• 3.3 作为hK7的抑制剂,SLPI与hK7的关系
• 3.4 hK7和SLPI有可能成为肿瘤标记物
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 学习期间发表论文