糙皮侧耳菌丝体与子实体原基抑制消减文库的构建及分析

论文摘要

糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）为侧耳属（Pleurotus）的模式物种,是世界上四大栽培食用菌之一,以其鲜美的风味及良好的营养、药用、经济价值受到人们的青睐。糙皮侧耳的生活史由担孢子（basidiospore）、菌丝体（mycelium）、原基（primordium）和子实体（fruiting body）等阶段构成,在双核菌丝纽结发育为原基的过程中,形态上的改变最为明显,可能是通过酶活性与离子浓度的改变来影响菌丝的生理代谢,也可能是通过调节细胞内的基因表达来影响糙皮侧耳的生长发育,目前对于糙皮侧耳发育过程中的分子机理研究较少。研究糙皮侧耳分化发育过程中菌丝体和子实体原基的差异表达基因,对研究糙皮侧耳分化发育分子机理及分子育种有重要意义。本课题以实验室保藏菌株Po739为试验菌株,其培养所得到的菌丝体M739和子实体原基P739作为实验材料,应用抑制性消减杂交技术,构建了以菌丝体为检测对象的正向消减文库和以子实体原基为检测对象的反向消减文库。经菌落PCR检测,正、反向文库插入片段的大小在250 bp-1000 bp之间,有效重组率分别达到了85.4%和83.0%。经过反式Northern杂交对其进行初步的筛选后,分别从正向文库和反向文库中选取200个颜色有明显差异的克隆进行测序。将测序所得序列在GenBank数据库中进行同源性比较,对其基因功能进行注释,再用GO （Gene Ontology）基因功能分类系统对其进行分类。结果显示,正、反向文库中分别有69.5%和66.5%的基因获得功能注释,涉及到了催化活性、调节酶活性、结合、运输、信号转导、调控翻译、分子伴侣、细胞途径、生物学途径、发育、细胞内组分、膜等多个方面。选取比对后得到的线粒体加工肽酶（mitochondrial-processing peptidase, MPP）、电压依赖性离子选择通道（voltage-dependent anion channel, VDAC）设计引物,利用RT-PCR对其进行半定量分析,证明其在M739和P739中的确为差异表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 糙皮侧耳概况
• 1.1.1 糙皮侧耳的食用历史及营养、药用价值
• 1.1.2 糙皮侧耳的栽培及潜在价值
• 1.1.3 糙皮侧耳的生物学特性及生活史
• 1.2 差异表达基因的研究方法
• 1.2.1 mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）
• 1.2.2 代表性差异分析（RDA）
• 1.2.3 基因表达系列分析（SAGE）
• 1.2.4 cDNA芯片（cDNA Microarray）
• 1.2.5 抑制性消减杂交（SSH）
• 1.3 本课题研究目的、意义与主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌株
• 2.1.2 实验中所用Adaptor和Primer序列
• 2.2 主要试剂耗材与设备
• 2.2.1 主要实验试剂与耗材
• 2.2.2 实验耗材预处理
• 2.2.3 实验设备
• 2.3 培养基与溶液配制
• 2.3.1 培养基配制
• 2.3.2 溶液配制
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 菌种活化
• 2.4.2 实验材料的培养
• 2.4.3 M739和P739总RNA的提取
• 2.4.4 抑制性消减杂交文库的构建
• 2.4.4.1 cDNA第一链的合成
• 2.4.4.2 cDNA第二链的合成
• 2.4.4.3 RsaⅠ酶切
• 2.4.4.4 接头连接
• 2.4.4.5 接头连接效率分析
• 2.4.4.6 第一次杂交
• 2.4.4.7 第二次杂交
• 2.4.4.8 PCR扩增
• 2.4.4.9 消减效率分析
• 2.4.4.10 消减产物连接载体
• 2.4.4.11 连接产物转化
• 2.4.4.12 文库插入片段长度检测及筛选
• 2.4.5 SSH文库的筛选——反向Northern杂交
• 2.4.5.1 杂交膜的准备
• 2.4.5.2 点膜
• 2.4.5.3 探针的制备与标记
• 2.4.5.4 分子杂交
• 2.4.5.5 免疫学检测
• 2.4.6 差异表达克隆的挑取及测序
• 2.4.7 差异表达基因的RT-PCR检测
• 2.4.7.1 M739和P739总RNA的提取
• 2.4.7.2 cDNA第一链的合成
• 2.4.7.3 PCR扩增
• 3 结果与分析
• 3.1 M739和P739总RNA的提取
• 3.2 双链cDNA的合成与酶切效果检测
• 3.3 接头连接效率检测
• 3.4 消减杂交后产物的两轮PCR扩增结果
• 3.5 消减效率的PCR分析
• 3.6 文库插入片断大小检测
• 3.7 反向Northern杂交筛选
• 3.8 测序结果与序列分析
• 3.9 RT-PCR结果分析
• 4 讨论
• 4.1 材料的选择及RNA提取
• 4.2 SSH文库的构建过程探讨
• 4.3 反向Northern杂交过程
• 4.4 SSH技术中得到的差异表达基因
• 4.4.1 线粒体加工肽酶（MPP）
• 4.4.2 电压依赖性阴离子通道（VDAC）
• 5 下一步工作
• 参考文献
• 致谢
• 研究生在读期间发表文章