论文摘要
目的:肾间质纤维化是各种原因造成的肾小管及肾间质病变的最终结果,是所有慢性肾脏疾病发展至终末期肾衰竭的共同通路。肾间质纤维化的发生发展是一个复杂的过程,该过程涉及肾小管上皮及间质的损伤,细胞因子和炎症介质的产生,炎性细胞的浸润,成纤维细胞的增殖,细胞外基质的增多等一系列相互关联的过程,涉及多种细胞因子的参与。转化生长因子β1 （Transforming growth factor TGF-β1）是研究最多也是最重要的致纤维化因子。其可通过促进基质成份大量产生,以及趋化和活化炎性细胞,介导肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化,导致肾小球硬化及小管间质纤维化,最终发展至终末期肾衰竭。血小板反应蛋白1 （thrombospondin -1 TSP - 1）作为多肽类内源性血管新生抑制物中重要的一员,其可抗血管新生,进而导致肾间质纤维化。近年的研究发现,TSP-1能激活内皮细胞分泌潜在的TGF-β,从而抑制内皮细胞生长。TSP-1作为一种体内关键的转化生长因子β1 （TGF-β1）活化因子,在肾脏疾病中的重要作用越来越受到关注。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor VEGF）,具有营养、活化、促进血管生成的性能,对内皮细胞的增殖有着不可或缺的作用。近年的研究发现,VEGF与肾间质纤维化关系亦较为密切。I型胶原（type I collagen）是肾间质纤维化的重要细胞外基质成分,I型胶原的过度表达是形成肾脏间质纤维化、肾小球硬化的过程中的一个重要环节。雷帕霉素（rapamycin ,RAP）是由链球菌属产生的一种大环内酯类抗免疫抗生素,目前雷帕霉素主要是作为一种免疫抑制剂用于器官移植后的患者,包括肾移植术后。近年来的研究发现,雷帕霉素对延缓CKD的进展也可能发挥非常有益的作用,其很可能会成为治疗CKD、延缓肾功能损害进展的一个有潜力的药物。本课题拟通过建立单侧输尿管梗阻（ unilateral urethral obstruction , UUO ）诱导的大鼠肾间质纤维化模型,结合免疫组织化学等检测手段,观察雷帕霉素对肾间质纤维化大鼠肾组织中TSP-1、VEGF、TGF-β1及I型胶原表达的影响,探讨雷帕霉素对肾间质纤维化的保护作用,为临床防治肾间质纤维化提供试验性理论依据。方法:选择清洁级SD大鼠54只（雄性）,体重（200±20）克,适应性喂养1周后,随机分为三组:对照组（A组）,UUO模型组（模型组,B组）和雷帕霉素治疗组（治疗组,C组）,每组各18只。每组又分别于术后第3、7、14天分批取出梗阻侧肾组织,分别为N3、N7、N14组,每组各6只。B、C组大鼠以水合氯醛（0.1ml/kg）腹腔注射麻醉。无菌条件下于左侧背部脊柱旁1.5 cm、肋下1 cm行纵形切口,逐层分离,沿左肾下极寻找左侧输尿管,为预防发生逆行性感染,在左侧输尿管中上1/3处分别结扎上下两处,然后从中剪断。A组不结扎、剪断输尿管,余过程同前。各组于手术前1天开始给药,每天灌胃1次,每周复查体重,调整给药量。治疗组以雷帕霉素2 mg/kg/d灌胃,对照组及模型组以等容的生理盐水灌胃,实验期间自由进食水。各组分别于术后第3天、7天、14天随机选取6只大鼠分三批取出梗阻侧肾组织,置于固定液中,分别采用苏木素伊红（HE）染色、Masson染色观察各组大鼠肾组织病理变化,并采用免疫组织化学方法测定肾间质TSP-1、VEGF、TGF-β1及I型胶原的表达,应用图像分析系统进行半定量分析。实验结果均以均数±标准差（ x±s）表示,采用多因素方差分析,应用SPSS 13.0统计分析软件对实验数据进行统计学处理,P<0.05为有统计学意义。结果:光镜下,HE染色A组未见异常,B组在术后3天可见肾小管轻度扩张,肾间质可见炎症细胞局部浸润;第7天肾小管明显扩张,可见肾小管上皮细胞变性、坏死,肾间质有大量炎症细胞浸润,肾间质宽度明显增加;第14天可见较多萎缩的肾小管,肾小管基底膜弥漫性增厚、皱缩,伴有不同程度的断裂。Masson染色A组未见异常,B组在术后3天可见肾小管轻度扩张,胶原纤维增加;术后7天及14天,肾小管扩张程度逐渐加重,胶原纤维明显增多,间质纤维化明显。免疫组织化学结果显示:TGF-β1在A组无或仅在肾小管上皮细胞中有微量表达;在B组随梗阻时间延长,其表达进行性升高,与A组同时相点相比均有统计学差异（P<0.05）;在C组,TGF-β1的表达与同期B组相比均有所降低（P<0.05）,但仍高于同期A组（P<0.05）的表达。TSP-1在A组无表达;在B组广泛表达于肾小管上皮细胞胞浆,且随着梗阻时间的延长,表达逐渐增多,与A组相比,有统计学意义（P<0.05）;在C组,TSP-1的表达与同期B组相比均有所降低（P<0.05）,但仍高于同期A组（P<0.05）的表达。I型胶原在A组仅少量表达于肾间质及肾脏较大的血管壁中;在B组广泛表达于肾小管及肾间质,且随着梗阻时间的延长,表达逐渐增多,与A组相比,有统计学意义（P<0.05）; I型胶原在C组各时期的表达与同期B组相比均有所降低（P<0.05）,但仍高于同期A组的表达（P<0.05）。VEGF在A组各时期广泛表达于肾小球脏层上皮细胞及肾小管上皮细胞;在B组于第3天表达升高,与A组相比有统计学意义（P<0.05）,随着肾间质病变的加重,其表达渐渐减少,第14天仅在少许的肾小管上皮细胞中有表达,与A组相比,第7天、第14天的表达均低于同期A组（P<0.05）;在C组,VEGF于术后第3天的表达与同期B组相比无明显差别,与A组相比有所升高,有统计学意义（P<0.05）,而第7天、第14天VEGF的表达均高于同时期B组的表达（P<0.05）,但均低于同期A组（P<0.05）。结论:在单侧输尿管梗阻大鼠肾间质中,TSP-1、TGF-β1及I型胶原的表达随着梗阻时间的延长、肾小管间质病变程度的加重而逐渐增加,而VEGF的表达随着梗阻时间的延长逐渐降低,最终出现肾间质纤维化。雷帕霉素可抑制肾间质纤维化大鼠TSP-1、TGF-β1及I型胶原的过度表达,促进VEGF的表达,从而能够改善UUO大鼠肾脏组织形态学变化,减轻肾小管扩张,并减少肾小管间质胶原的沉积,延缓肾间质纤维化。
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