引起鸡与鹌鹑属间杂交种性分化异常相关基因的研究

论文摘要

鸡与鹌鹑属间杂交是一类比较典型的远缘杂交,其杂交不育的一个重要表现是杂交种胚胎孵化早期死亡,死亡集中时间为3-5天,与其性分化时期吻合,已有研究证实雌激素受体（ER）在杂交种胚胎早期死亡中起着重要作用。ER的重要功能之一是调控雌激素的表达,在家禽中雌激素对性别分化起着调控作用,因此推断雌激素对引起鸡与鹌鹑属间杂交种胚胎早期死亡有着重要的作用。家禽体内雌激素的转化需要羟基类固醇脱氢酶和17α羟化酶的作用,探明这些基因在杂交种胚胎孵化早期的表达机制及胚胎早期死亡的关系,进一步了解鸡与鹌鹑属间杂交种胚胎早期死亡的分子机制。本研究在克隆鹌鹑和杂交种3β-HSD和P-450c17基因全长序列的基础上,将这两个基因定位于鸡、鹌鹑和杂交种胚胎发育的早期,并进行了相关基因的定量表达研究,结果如下：1.鹌鹑及其属间杂交种3β-HSD和P-450c17cds区全长基因克隆和序列分析对3β-HSD基因和P-450c17基因：鸡的全长序列已有报道,鹌鹑的报道了部分序列,杂交种上国内外均未见报道。本研究以鹌鹑及其杂交种早期胚胎为研究对象,利用RT-PCR和染色体步移技术,对3β-HSD和P-450c17基因序列进行克隆测序及蛋白质预测,首次获得了属间杂交种3β-HSD cds的全长序列1134bp （提交GenBank, ID为：FJ607243）,鹌鹑3(3-HSD cds的全长序列（提交GenBank, ID为：FJ607242）；属间杂交种P-450c17 cds全长序列989bp（提交GenBank, ID为：FJ607243）。结果表明：鸡与杂交种的同源性较高,鹌鹑与杂交种的同源性较低。对两个基因的蛋白质预测结果分析,它们都可能是球状蛋白。3β-HSD蛋白,鸡与杂交种相似性较大,而鹌鹑与其它两个差异较大；P-450c17蛋白,则表现为鹌鹑与杂交种相似性较大,而鸡与其它两个差异较大。2.3β-HSD、P-450c17在鸡、鹌鹑及其属间杂交种早期胚胎中的定位3β-HSD和P-450c17作为ER的重要调控酶之一,其具体表达部位在鸡与鹌鹑杂交种上未见有报道。本研究以鸡、鹌鹑及其杂交种早期胚胎为研究对象,通过整体原位杂交的方法,对3.5-5d的鸡、鹌鹑及其杂交种早期胚胎的3β-HSD和P-450c17基因表达部位进行定位检测。结果表明：3β-HSD和P-450c17基因主要表达于性腺生殖嵴原基周围。3β-HSD基因在雌性杂交种96h、102 h、108h的胚胎中存,即有表达,3β-HSD在雌性胚胎中表达信号较强,同时雄性胚胎在66-132h也有表达；P-450c17基因在雌性杂交种96h、102h、108h胚胎中存在阳性蓝色信号,亦是有表达。同时研究结果表明3β-HSD在72h、84h和96h雌性胚胎心脏部位可能也有表达。3. ER、3β-HSD和P-450c17基因在鸡、鹌鹑及其属问杂交种早期胚胎中的表达分析本试验采集66-168h的鸡、鹌鹑及其杂交种胚胎各5枚,采用Real-time PCR的方法获得目的基因ER、3β-HSD和P-450c17在胚胎早期mRNA表达丰度图。结果表明：1.ER基因：鸡在108h附近为表达高峰期；鹌鹑在96h之前表达不稳定,至102h附近为表达高峰期；杂交种在72h附近出现一个较低的表达高峰期,之后开始下降,96h时再次出现一个较高的表达高峰期,由此可知,鸡、鹌鹑和杂交种的ER在胚胎早期几乎都存在两个表达峰,其中鸡与鹌鹑的表达峰为前高后低,而杂交种为前低后高。2.P-450c17基因：鸡在108h附近为表达高峰期；鹌鹑在96h附近为表达高峰期；杂交种90h附近表达量达到高峰期。该基因在杂交种胚胎中的表达量较高,而鹌鹑的相对较低。3.3β-HSD基因：鸡在108h附近达到表达高峰期；鹌鹑在120h附近为表达高峰期；杂交种整体表达水平极低,大致可以看出在90h附近出现一个表达峰值,前后表达量变化差异不明显。鸡、鹌鹑及其杂交种三种基因的表达峰值都出现在90-108h,杂交种表现出较两亲本提前表达的趋势；ER较3β-HSD、P-450c17基因提前表达,表达的量表现出与其亲本有较大差异,同时其表达的时间与胚胎死亡的时间基本吻合。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 文部分缩写的中英文对照
• 引言
• 上篇 文献综述
• 1 鸡与鹌鹑远缘杂交研究进展
• 1.1 鸡与鹌鹑远缘杂交研究现状
• 1.2 鸡与鹌鹑远缘杂交存在的问题
• 1.3 鸡与鹌鹑杂交种早期胚胎死亡机理的研究进展
• 2 雌激素受体及相关类固醇类基因在家禽中的相关研究
• 2.1 雌激素受体在家禽中的相关研究
• 2.2 类固醇类基因在国内、外的研究进展
• 3 相关实验技术在基因表达研究中的应用
• 3.1 原位杂交技术在基因表达研究中的应用
• 3.2 实时定量PCR技术在基因表达研究中的应用
• 下篇 实验研究内容
• 第一章 鹌鹑及其与鸡属间杂交种3β-HSD和P-450c17cds区全长基因克隆测序及蛋白预测
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 样品总RNA质量
• 2.2 电泳回收
• 2.3 3β-HSD同源性分析
• 2.4 P-450c17同源性分析
• 2.5 编码3β-HSD和P-450c17蛋白的理化特性和二级结构预测
• 3.讨论
• 4.小结
• 第二章 3β-HSD和P-450c17在鸡、鹌鹑及其属间杂交种早期胚胎中的定位
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料与主要试剂
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 3β-HSD和P-450c17 PCR产物扩增图
• 2.2 目的基因的克隆
• 2.3 鸡、鹌鹑及其杂交种3β-HSD和P-450c17基因的同源性比较
• 2.4 地高辛标记探针效率检测结果
• 2.5 鸡与鹌鹑及其属间杂交种胚胎中3β-HSD和P-450c17的定位
• 3.讨论
• 4.小结
• 第三章 ER、3β-HSD和P-450c17基因在鸡、鹌鹑及其属间杂交种早期胚胎中的表达分析
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料与主要试剂
• 1.2 实验方法
• 2.结果与分析
• 2.1 熔解曲线分析结果
• 2.2 扩增曲线分析结果
• 2.3 标准曲线分析结果
• 2.4.内参β-actin及ER、3β-HSD和P-450c17基因的拷贝数和浓度比值表
• 2.5 三个基因实时定量曲线结果分析图
• 3.讨论
• 4.小结
• 全文结论
• 展望
• 创新
• 参考文献
• 附录1 主要溶液的配制
• 附录2
• 附录3 大肠杆菌感受态细胞的制备及原位杂交过程
• 作者简介
• 致谢
• 导师评阅表