三角涡虫酪蛋白激酶2α亚基和丝裂原活化蛋白激酶的cDNA文库克隆及生物信息学分析

论文摘要

三角涡虫（Dujesia japonica）属于扁形动物门涡虫纲,是研究神经生物学、再生生物学以及发育生物学的模式动物。三角涡虫具有独特的再生能力以及形态学的可塑性,所以近年来对涡虫的研究主要集中在再生机制和分子生物学方面,基因组学和功能基因组学等方面的研究将有助于从基因组水平上阐述后生动物再生、发育和进化的机制。采用Clontech公司CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit技术来构建涡虫的cDNA文库,分别利用RT-PCR和PCR技术对其进行了鉴定,从构建的文库中挑选出部分克隆进行测序并拼接其序列,本实验选择了编码酪蛋白激酶2α和丝裂原活化蛋白激酶的全长cDNA序列,并进行了详细的生物信息学分析,为涡虫功能基因组学的研究提供一定的数据。主要研究结果如下：丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated proteinkinases, MAPKs）是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者,本实验获得的丝裂原活化蛋白激酶基因的cDNA序列全长约1315bp,其开放性读码框的长度为1068 bp,编码355个氨基酸。GC含量为38.48%,为亲水性蛋白质,主要位于细胞质中；蛋白分子量约为41359.5kd,理论等电点pI为6.24,蛋白质稳定,不具信号肽,不含跨膜位点；该蛋白属于PKclike超家族,含有33个活性位点,21个ATP结合位点,12个底物结合位点,21个KIM停泊位点；相似性及分子进化分析表明,三角涡虫丝裂原活化蛋白激酶MAPK与其他动物的丝裂原活化蛋白激酶MAPK有62%-66%的相似性,MAPK在不同物种之间如此保守,说明它在生物体内具有非常基础而重要的作用。酪蛋白激酶2 （casein kinase 2,CK2）是一种高度保守且具有多种生理功能的丝氨酸/苏氨酸激酶,广泛存在于各种真核生物中,该蛋白的α亚基具有独立的细胞功能,很可能起到癌基因的作用。酪蛋白激酶2α的cDNA序列全长2004 bp,包含一个长度为1083bp的开放性读码框,编码360个氨基酸,GC含量为39.27%,为亲水性蛋白质,主要位于细胞质中；蛋白分子量约为41764.2 kd,理论等电点PI为6.43,蛋白不稳定,不具信号肽,不含跨膜位点；该蛋白属于PKc like超家族,含有26个活性位点,20个ATP结合位点,11个底物结合位点。相似性及分子进化分析表明,酪蛋白激酶2α与其他物种酪蛋白激酶2α相似性为69%-74%,说明了CK2的氨基酸序列在进化是高度保守性的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1 蛋白激酶综述
• 1.1 蛋白激酶的发现、研究历史以及定义
• 1.2 蛋白激酶的分类
• 1.3 蛋白激酶的结构
• 1.4 蛋白激酶细胞定位
• 2 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）
• 3 酪蛋白激酶2（CK2）
• 4 三角涡虫概述
• 4.1 涡虫形态分类学
• 4.2 涡虫的生活习性
• 5 cDNA文库的构建
• 5.1 cDNA文库的分类
• 5.2 全长cDNA文库的构建
• 5.3 SMART技术原理
• 5.4 DSN均一化技术
• 5.5 构建cDNA文库的基本步骤
• 第2章 实验材料和方法
• 1 实验材料
• 1.1 采集三角涡虫
• 1.2 培养三角涡虫
• 2 实验主要仪器
• 3 实验试剂
• 4 实验方法
• 4.1 三角涡虫总RNA的制备
• 4.2 cDNA的合成与文库的构建
• 4.3 回收目的片段
• 4.4 产物的连接和转化
• 5 文库的鉴定
• 5.1 三角涡虫总RNA的制备
• 5.2 cDNA第一链的获得
• 5.3 cDNA质量的检测
• 5.4 文库克隆的检测
• 6 生物信息学分析工具
• 6.1 核酸序列分析
• 6.2 氨基酸序列分析
• 第3章 实验结果
• 1 检测总RNA的质量
• 1.1 检测吸光度
• 1.2. 总RNA的凝胶电泳检测
• 2 cDNA质量的检测
• 3 均一化结果
• 4 cDNA文库的质量
• 4.1 cDNA文库的库容量
• 4.2 cDNA文库的滴度
• 4.3 连接产物的菌落PCR鉴定
• 5 cDNA文库的鉴定
• 5.1 RNA提取的凝胶电泳检测
• 5.2 cDNA质量的检测
• 5.3 文库克隆MAPK的检测
• 第4章 MAPK和CK2A亚基的生物信息学分析
• 1 开放性阅读框分析
• 1.1 丝裂原活化蛋白激酶的开放性阅读框分析
• 1.2 酪蛋白激酶2α亚基的开放性阅读框分析
• 2 CDD分析
• 3 氨基酸序列同源性分析
• 4 蛋白质理化性质分析
• 5 疏水性分析
• 6 信号肽预测
• 7 亚细胞定位分析
• 8 蛋白质跨膜结构域分析
• 9 蛋白质二级结构预测
• 10 蛋白质三级结构预测
• 11 磷酸化位点预测
• 12 系统发育分析
• 第5章 讨论
• 第6章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果