论文摘要
目的探讨皮肤挫伤修复过程中，caspase-6在挫伤区及挫伤周边区不同时间表达的变化规律。方法1、动物模型的建立和分组健康成年雄性SD大鼠30只，体质量220-250g，随机分为10组，每组3只，其中9组为实验组，1组为正常对照组。用2％戊巴比妥钠（0.45mg／kg体重）腹腔注射麻醉后，参照Kami等的大鼠骨骼肌急性钝挫伤模型制作方法，用重500g的自制打击器，从54cm高处自由垂直落下打击动物右小腿皮肤。分别于伤后3h、6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d、14d将大鼠脱颈椎处死，取做好标记的皮肤组织，对照组大鼠同样方法处理后不作打击，处死后取与损伤组大鼠相同部位，大小相等的皮肤组织作为对照，OCT包埋后，液氮速冻，5μm厚度切片。2、免疫组织化学染色（SP法）（1）室温晾干；（2）3％H2O2／PBS，室温孵育20min；（3）0.3％Triton X-100中20min；（4）非免疫血清封闭，室温孵育20min；（5）一抗1∶100倍稀释，4℃孵育过夜；（6）生物素化兔抗山羊二抗，室温孵育20min；（7）SP试剂，室温孵育20min；（8）DAB显色，3min，苏木素核复染、透明、中性树胶封片。同时进行常规H．E染色。caspase-6抗体购自美国Santa Cruz公司、SP试剂盒购自北京中杉金桥生物试剂公司。3、Caspase-6的Western blot检测（1）蛋白定量；（2）电泳；（3）转印；（4）封闭抗原，采用含有0.1％Tween-20的5％脱脂奶粉封闭液；（5）山羊抗大鼠caspase-6抗体孵育；（6）兔抗山羊二抗孵育；（7）ECL显色。结果1、皮肤挫伤的宏观所见伤后3h组出血、水肿明显，呈鲜红色；6h组出血、水肿程度减轻；1d组挫伤区仍有水肿，出血明显减轻；3d组水肿几乎全部吸收，挫伤处皮肤呈棕黄色；5d组挫伤区皮肤仅可见呈浅黄色改变；7d～14d组挫伤区皮肤与正常对照组皮肤相同。2、组织学所见伤后3h组挫伤处表皮层与真皮层分离，真皮内毛细血管扩张充血，少量多型核细胞浸润；6h组挫伤周边区中性粒细胞浸润增多；12h组单个核细胞开始大量浸润，1d达高峰；3d组多型核细胞明显减少，成纤维细胞和单核细胞大量浸润；5d组胶原成分增多，细胞数目明显减少；7d～14d大量胶原纤维形成。3、Caspase-6在皮肤损伤修复过程中损伤区及损伤周边区的表达对照组标本中，caspase-6只在表皮层、毛囊、皮脂腺处表达。挫伤组标本中，伤后3h组挫伤区真皮层内有成纤维细胞浸润，6h组成纤维细胞阳性染色进一步增多，12h、1d、3d组达到高峰，5d组成纤维细胞阳性染色减少，7d组、10d组成纤维细胞阳性染色继续下降，14d组降至最低。伤后3h组挫伤区皮下组织处开始有多型核细胞浸润，6h组、12h组挫伤区浸润的细胞数量逐渐增多，caspase-6阳性细胞主要为多型核细胞和单个核细胞，1d组多型核细胞和单个核细胞数目最多，3d组出现大量成纤维细胞阳性染色，5d～14d组caspase-6阳性细胞以成纤维细胞为主。免疫组织化学染色阴性对照组切片caspase-6无阳性染色。阳性细胞计数及统计学分析：伤后3h组，阳性细胞比率为（25.78％±1.38％），6h组阳性细胞比率继续增高（36.21％±4.25％），12h组阳性细胞比率增高明显（47.70％±5.14％），1d组阳性细胞比率进一步增高（50.62％±5.42％），3d组caspase-6阳性细胞率达到最高（54.58％±5.64％）。伤后5d组开始下降（28.39％±4.50％），7d、10d组进一步下降，且阳性细胞率基本维持在一个相对稳定的水平（23.75％±3.12％，20.43％±2.36％），14d组阳性细胞率下降至（11.31％±2.19％）。经统计学方差分析，各时间段相邻两组之间caspase-6阳性细胞率相比均存在显著差异（P＜0.01）。4、Western blot分析实验组中，1d、3d、5d组可见明显的10kD caspase-6活化片段。结论大鼠皮肤挫伤修复过程中，caspase-6在挫伤后的炎症反应中发挥重要作用；同时，caspase-6在挫伤区内多型核细胞、单个核细胞及成纤维细胞中的表达呈规律性变化，可对挫伤时间的推断提供参考。