论文摘要
氧化应激与多种病理状态密切相关,包括癌症,衰老和心血管疾病等。DNA是氧化应激损伤的重要靶分子之一,形成的DNA氧化性损伤主要经碱基切除修复（BER）进行修复。APE1为BER途径的限速酶,其表达水平高低对于BER的活性至关重要。线粒体是除细胞核外唯一具有基因组DNA的细胞器,由于缺乏组蛋白,蛋白编码区密集无内含子,加之与电子转运链相邻,mtDNA极易受到氧化应激的损伤,有研究表明正常细胞mtDNA氧化损伤稳态的水平是nDNA的3-15倍。然而,正常细胞mtDNA修复活性较弱,通过基因治疗的手段提高mtDNA修复能力成为增强细胞对氧化应激耐受性的新策略。外源性上调多种DNA糖基化酶的线粒体表达水平能有效增强mtDNA的修复活性从而提高哺乳动物细胞在氧化应激条件下的存活率。但是由于糖基化酶的底物特异性高,仅能针对单一损伤进行修复,因此更多的研究集中在作用于BER共同通路的修复酶APE1,希望通过增强其活性达到更为广泛的修复增强效应。有研究在线粒体中成功过表达全长野生型APE1基因或APE1的同源基因,但却无显著的细胞效应或产生与预期截然相反的效应。最近有研究报道线粒体型与全长型APE1相比缺乏N端序列却具有比全长型APE1更强的DNA修复活性,然而对于APE1这种缺乏典型的MTS的细胞核编码的基因,其进入线粒体的机制仍未完全明了。因此本研究首先观察在不同的氧化应激刺激下不同细胞株中APE1的亚细胞分布的改变情况,讨论其在氧化应激反应中的生物学效应,然后拟构建N端截短型APE1基因的线粒体表达载体增强其线粒体表达,探讨其对血管内皮细胞mtDNA修复能力的影响,并进一步观察其对细胞在氧化应激状态下凋亡和增殖的影响效应,最后对APE1的线粒体定位信号进行研究,为以线粒体APE1为靶点的基因治疗提供理论基础及可行策略。研究目的1.探讨不同的处理因素诱导的氧化应激状态下不同细胞中APE1的线粒体转位情况及差异;2.探讨截短型APE1基因线粒体定位表达对人内皮细胞在氧化应激后存活和增殖能力的影响；3.探讨APE1线粒体定位信号存在的可能区域，为进一步研究其线粒体定位机制奠定基础。研究内容和方法1.氧化应激对APE1亚细胞定位的影响：采用激光共聚焦显微镜观察FITC标记的APE1在氧化应激后细胞内定位的变化，同时提取线粒体组分蛋白证实形态学观察。分析氧化应激对APE1亚细胞定位的影响及与不同细胞直接变化的差异，为进一步以线粒体APE1为靶点的基因治疗提供理论基础。2.截短型APE1线粒体定位表达载体的构建及其生物学效应：以真核表达质粒pcDNA3.1（+）为载体，首先通过PCR得到MTS和NDAPE1序列，而后经过SOE得到拼接的基因，与线性化pcDNA3.1（+）质粒连接后构建pcDNA-mtAPE1-HA，经测序鉴定。采用激光共聚焦显微镜观察转染pcDNA-mtAPE1-HA后的亚细胞定位；Western blot和APE活性分析检测其对HUVE细胞线粒体APE1水平和mtDNA修复能力的增强作用；利用MTT和克隆形成实验检测氧化应激后的细胞存活和增殖能力，用流式细胞仪检测细胞凋亡，并用Western blot检测细胞色素C的胞浆释放。3. APE1线粒体定位信号的研究：构建C端带有EGFP和HA标签的不同长度的截短型APE1融合蛋白，用激光共聚焦观察细胞内的分布情况推测其线粒体定位信号大致的分布区域。研究结果1.氧化应激对APE1亚细胞定位的影响：电离辐射后3小时内骨肉瘤细胞中APE1分布由照射前细胞核分布转变为以胞浆为主的分布，3小时线粒体APE1增加超过30倍；H2O2处理后3小时内血管内皮HUVE细胞APE1仅少量转位进入线粒体，3小时内线粒体APE1水平增加不超过5倍。2.截短型APE1线粒体定位表达载体的构建及其生物学效应：经测序分析表明成功构建重组表达载体pcDNA-mtAPE1-HA和对照载体pcDNA-flAPE1-HA。转染HUVE细胞发现pcDNA-mtAPE1-HA能显著增加线粒体APE1水平，而pcDNA-flAPE1-HA则明显增加细胞核APE1水平，两者均能轻度增加胞浆APE1水平。pcDNA-mtAPE1-HA转染能明显增加线粒体APE活性，而不增加胞核APE活性；pcDNA-flAPE1-HA则仅能轻度增加胞核APE活性，不增加线粒体APE活性。在不同浓度H2O2诱导的氧化应激后，pcDNA-mtAPE1-HA转染能提高血管内皮细胞细胞存活和增殖能力，同时降低细胞凋亡率，而pcDNA-flAPE1-HA与对照组无显著差异。进一步分析发现，pcDNA-mtAPE1-HA转染可抑制H2O2处理后细胞色素C的胞浆释放。3. APE1线粒体定位信号的研究：带有EGFP标签的载体pEGFP-（42-318）-APE1，pEGFP-（60-318）-APE1，pEGFP-（249-318）-APE1和pEGFP-（288-318）-APE1表达的融合蛋白在细胞内均出现非特异性全细胞弥散分布，而C端带有HA标签的表达载体pEGFP-（42-318）-APE1-HA，pEGFP-（60-318）-APE1-HA和pEGFP-（249-318）-APE1-HA出现特异性线粒体定位而pEGFP-（288-318）-APE1-HA则为非特异性全细胞弥散分布，由于这种亚细胞分布形式差异发生于249-288位氨基酸残基的缺失，因此推测为改区域可能存在线粒体定位信号。结论1.在电离辐射处理后早期，骨肉瘤HOS细胞内APE1分布由单纯细胞核表达向胞浆为主表达转变；而在H2O2处理后早期，血管内皮HUVE细胞内少量APE1由细胞核向线粒体转位。氧化应激后早期APE1线粒体转位是普遍现象，但是其程度和速度与不同细胞株对不同的处理因素敏感性差异相关。2.通过将线粒体定位序列融合于N端33氨基酸序列缺失的APE1序列并构建真核表达载体转染至血管内皮HUVE细胞中能显著增强线粒体APE1水平，而全长APE1真核表达载体转染仅能增加细胞核APE1水平。3.截短型APE1线粒体特异性过表达能显著增加血管内皮细胞在H2O2诱导的氧化应激后细胞存活及其增殖能力，而全长APE1过表达对H2O2诱导的细胞死亡无保护效应。4.截短型APE1线粒体过表达增加血管内皮细胞在氧化应激后细胞存活，是通过阻断线粒体途径细胞凋亡实现的。5. APE1的线粒体定位序列可能存在于C端的249-288位氨基酸残基区域内。6.构建带有蛋白质标签的融合蛋白时，C端较大的标签如EGFP很可能影响APE1线粒体定位序列的暴露，从而干扰其线粒体定位；而小肽标签如HA则能较好的暴露线粒体定位序列。
论文目录
相关论文文献
- [1].APE1、VEGF在非小细胞肺癌组织中的表达及其与预后的关系[J]. 天津医科大学学报 2011(02)
- [2].携带人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)基因重组慢病毒载体的构建及体外表达检测[J]. 重庆医科大学学报 2011(09)
- [3].APE1和VEGF在非小细胞肺癌组织中的表达及其与肿瘤血管生成和预后的关系[J]. 重庆医学 2012(11)
- [4].APE1和Ki67蛋白在胃癌组织中的表达及其临床意义[J]. 江苏医药 2012(19)
- [5].外周T细胞淋巴瘤APE1和P53蛋白联合表达的临床意义[J]. 第三军医大学学报 2009(06)
- [6].siRNA靶向干扰APE1基因对脑胶质瘤细胞增殖凋亡及放疗敏感性的影响[J]. 山东医药 2012(24)
- [7].APE1基因沉默增强骨肉瘤U2-OS细胞硼替佐米治疗敏感性的实验研究[J]. 中国肿瘤临床 2012(08)
- [8].膀胱移行细胞癌组织APE1与VEGF表达及意义[J]. 齐鲁医学杂志 2009(03)
- [9].卵巢上皮癌细胞株间APE1单核苷酸多态性的研究[J]. 现代生物医学进展 2013(10)
- [10].APE1在卵巢上皮性癌中的表达及其临床意义[J]. 第四军医大学学报 2008(19)
- [11].双功能基因APE1调控人骨肉瘤HOS细胞miRNAs的初步研究[J]. 第三军医大学学报 2014(19)
- [12].APE1单核苷酸多态性与肺癌易感性关系的研究[J]. 重庆医学 2011(06)
- [13].APE1与P-gp在晚期非小细胞肺癌中的表达及其临床意义[J]. 实用癌症杂志 2010(02)
- [14].APE1、XRCC1基因多态性对肝癌易感性及铂类药物敏感性的影响[J]. 军事医学 2014(01)
- [15].APE1和ERCC1基因多态性和肺腺癌易感性关系研究[J]. 医药论坛杂志 2014(05)
- [16].XRCC1、APE1单核苷酸多态性与食管癌放疗敏感性的相关性[J]. 山西医科大学学报 2014(10)
- [17].APE1在宫颈癌的表达及其与锎-252中子放疗预后的关系[J]. 四川大学学报(医学版) 2009(01)
- [18].骨髓瘤细胞表达APE1促进THP-1细胞破骨样分化[J]. 第三军医大学学报 2013(16)
- [19].APE1单核苷酸多态性与卵巢癌易感性关系的研究[J]. 现代肿瘤医学 2013(09)
- [20].XRCC1、PARP1和APE1多态性与晚期非小细胞肺癌铂类药物化疗敏感性的关系[J]. 南京医科大学学报(自然科学版) 2011(07)
- [21].RNA干扰骨髓基质细胞和/或骨髓瘤细胞APE1表达对共培养骨髓瘤细胞增殖及凋亡的影响[J]. 第三军医大学学报 2011(10)
- [22].卵巢上皮性癌组织APE1和P53的表达及其耐药性[J]. 第四军医大学学报 2008(06)
- [23].兔抗人APE1多克隆抗体的制备及鉴定[J]. 细胞与分子免疫学杂志 2009(04)
- [24].APE1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定[J]. 福建医科大学学报 2010(02)
- [25].碱基切除修复基因多态与氯乙烯致染色体损伤的易感性[J]. 复旦学报(医学版) 2008(02)
- [26].APE1和p53蛋白在A549细胞和HeLa细胞中的结合作用[J]. 第三军医大学学报 2013(21)
- [27].APE1在PDT治疗非小细胞肺癌中的表达变化及疗效的关系[J]. 重庆医学 2009(20)
- [28].APE1 rs1760944基因多态性与中国人群癌症易感风险关系的Meta分析[J]. 现代肿瘤医学 2014(10)
- [29].APE1在DEN诱导大鼠肝细胞癌形成过程中作用的研究[J]. 肿瘤预防与治疗 2008(02)
- [30].无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1的功能和表达调控[J]. 生命的化学 2010(04)
标签：放射治疗论文; 骨肉瘤论文; 氧化应激论文; 血管内皮论文; 基因治疗论文; 线粒体论文; 过表达论文; 损伤修复基因论文; 脱嘌呤论文; 脱嘧啶核酸内切酶论文; 氧化还原因子论文; 凋亡论文; 线粒体定位信号论文;