论文摘要
在胚胎发育的早期进行着旺盛的细胞有丝分裂,染色体正常分离到两个子细胞是保证有丝分裂正常进行的重要基础,而染色体的正常分离与着丝粒结构和功能、纺锤体检验点监控机制等有关。着丝粒蛋白质（Centromere proteins,CENPs）是着丝粒组装和功能发挥的基本组成单位,由位于着丝粒上的一组蛋白质（已发现的将近80余种[1]）构成,它们在细胞分裂间期或分裂期定位在着丝粒上,共同参与着丝粒的组装并影响其功能的正确行使。其中CENP-E不仅参与着丝粒的组装,而且还是纺锤体关卡蛋白检查点的重要组成部分,是联系着丝粒与纺锤体微管间的纽带,并提供染色体运动的动力[2、3、4、5]。CENP-I是着丝粒组装过程中较上游的一个蛋白质,在着丝粒装配和功能发挥过程中可能具有重要作用。Nishihashi等[6]研究发现在鸡的DT40细胞敲除CENP-I基因后,细胞将长时间停滞于分裂的前中期,并出现染色体错排。为了揭示在人类细胞中,CENP-E、CENP-I是否参与调控染色体分离和细胞正常分裂,本课题利用定量PCR、Western-blot和间接免疫荧光技术对染色体数目异常和核型正常的胚胎绒毛细胞中CENP-E、CENP-I的表达进行检测分析,发现与后者相比,染色体数目异常的胚胎绒毛细胞中CENP-E、CENP-I在mRNA水平和蛋白质水平上的表达均明显降低;并用RNAi技术构建CENP-E、CENP-I缺陷表达的人胚胎绒毛细胞模型,发现与未转染或转染空载体的胚胎绒毛细胞相比,CENP-E、CENP-I表达降低的胚胎绒毛细胞生长速度明显减慢,G2/M期细胞增加,分裂期细胞比例增大,染色体数目异常率显著增加。说明CENP-E、CENP-I参与着丝粒对细胞染色体分离和细胞增殖的调控,二者表达的降低可能是导致自然流产发生的重要原因。对CENP-E、CENP-I的进一步研究,将为研究染色体数目异常胚胎自然流产机制提供新的参考指标。第一部分着丝粒蛋白质CENP-I的原核表达、纯化及抗体制备目的:1、构建pET32a/CENP-I原核表达载体。2、纯化重组蛋白rCENP-I。3、将重组蛋白免疫兔制备抗CENP-I抗体。方法:1、用RT-PCR的方法从Hela细胞总RNA中获得编码CENP-I蛋白第1～293位氨基酸的CENP-I cDNA序列,采用基因体外重组法将其克隆到原核表达载体pET32a（+）内,获得重组质粒pET32a/CENP-I。2、将测序鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,用IPTG诱导表达、Ni2+-NTA亲和层析纯化获得高纯度的重组蛋白质。3、用纯化的蛋白质免疫家兔制备抗体,琼脂糖免疫双扩法、ELISA法和Western-blot得到高效价的免疫血清,并用饱和硫酸铵初步纯化抗体。结果:1、经测序鉴定,成功构建了重组表达质粒pET32a/CENP-I。2、重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化后在SDS-PAGE上呈现单一条带,灰度扫描后用Bandscan分析重组蛋白纯度达90%以上,成功的获得了rCENP-I蛋白。3、将rCENP-I蛋白免疫兔后获得了高效价的免疫血清,琼脂糖双扩显示免疫血清效价达1:16以上;ELISA法测免疫血清效价达1:20000,Western-blot显示抗体效价达1:400,能用于检测临床标本中的CENP-I蛋白。结论:成功的构建了pET32a/CENP-I表达载体、纯化了CENP-I重组蛋白,并制备了效价较高的抗CENP-I抗体。第二部分染色体数目异常的自然流产胚胎绒毛细胞中CENP-E和CENP-I基因表达的临床研究目的:1、通过T-A克隆获得FQ-PCR标准品。2、流产胚胎绒毛组织原代细胞培养,并通过染色体核型分析结果划分对照组和实验组。3、了解染色体数目异常的自然流产胚胎绒毛细胞中是否存在CENP-E和CENP-I基因的蛋白和/（或）mRNA水平的异常,探索靶基因的表达在染色体数目异常的胚胎发生中可能具有的作用。方法:1、设计、合成CENP-E、CENP-I和内参GAPDH基因的FQ-PCR引物和探针序列,进行普通PCR扩增,再将PCR产物与载体pMD18-T载体连接,构建靶基因的定量PCR标准品;2、采用组织块贴壁法、消化法和组织块研磨法原代培养流产绒毛组织,通过直接染色体制备法、传统染色体制备法和原位染色体制备法对培养的胚胎绒毛细胞进行染色体核型分析:将取自人工流产绒毛组织的染色体数目正常的胚胎绒毛细胞定为对照组,将来自自然流产绒毛组织的具有染色体数目异常核型的胚胎绒毛细胞定为实验组。3、用real-time RT-PCR检测CENP-E和CENP-I基因的mRNA水平的表达;4、用Western-blot和间接免疫荧光技术检测CENP-E和CENP-I蛋白水平的表达;结果:1、成功构建CENP-E、CENP-I和内参GAPDH基因的FQ-PCR标准品;2、成功培养胚胎绒毛细胞,并通过染色体核型分析,从人工流产绒毛组织中筛选到33例染色体数目正常的胚胎绒毛细胞,从自然流产的绒毛组织中筛选到23例染色体数目异常的胚胎绒毛细胞。3、real-time PCR、Western-blot和间接免疫荧光检测结果显示,与对照组相比,实验组中CENP-E和CENP-I的基因水平和蛋白质水平的表达均明显降低。结论:染色体数目异常的胚胎绒毛细胞中CENP-E和CENP-I表达降低可能是引起胚胎染色体数目异常和胚胎发育异常的重要原因之一,对进一步探索临床早期诊断指标和检测方法具有重要意义。第三部分RNA干扰技术抑制内源CENP-E或CENP-I基因在胚胎绒毛细胞中的表达目的:1、构建针对CENP-E和CENP-I基因的短发夹状RNA（shRNA）表达载体;2、shRNA重组表达质粒载体转染胚胎绒毛细胞后,观察靶基因表达的抑制。3、了解CENP-E和CENP-I基因的表达抑制对胚胎绒毛细胞增殖和染色体分离的影响,以及对细胞周期的调节。方法:1、设计、合成CENP-E和CENP-I基因的shRNA序列,与载体pgenesil-1连接,构建靶基因的shRNA重组表达质粒;2、shRNA重组质粒转染细胞后,用real-time PCR、Western-blot和间接免疫荧光检测mRNA水平和蛋白水平的变化,筛选有效的干扰质粒和最佳基因抑制时间。3、MTT法制备细胞生长曲线,检测基因抑制后对细胞生长的影响。4、FCM检测细胞周期的变化。5、细胞分裂指数测定和染色体核型分析检测基因抑制对染色体分离的影响。结果:1、成功构建针对靶基因的shRNA重组质粒。2、设计的干扰序列中pshRNA-CENP-E-3和pshRNA-CENP-I-3是有效的干扰质粒,于转染后72h胚胎绒毛细胞靶基因的内源性表达受到明显抑制,其蛋白水平和mRNA水平都显著下降。3、MTT实验发现有效干扰组细胞生长较对照组明显减慢,细胞增殖受到抑制。4、FCM检测显示干扰后G2/M期的细胞比例增加;细胞分裂指数测定结果示随转染时间增加实验组中分裂期细胞所占比例也增加;核型分析显示实验组中染色体数目异常细胞比例显著增加。结论:设计、合成针对靶基因的shRNA重组质粒在胚胎绒毛细胞中能有效抑制靶基因的表达,细胞生长减慢、分裂期细胞增多、染色体数目异常细胞比率增加,说明CENP-E和CENP-I对细胞增殖和染色体分离可能具有重要调控作用,成功构建CENP-E和CENP-I抑制后观察染色体数目异常变化的体外细胞模型,为后期的临床研究奠定基础。
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