基于CaN-NFAT3信号转导通路探究四逆汤及附子有效成分治疗心力衰竭大鼠的分子机制

论文摘要

研究背景：慢性心力衰竭是临床上非常常见的危重病症,是各种心血管疾病的最终转化结果,目前证实在心衰的发生过程中钙调磷酸酶（calcineurin,CaN）发挥了极其重的作用,同时在近几年心衰的研究中发现了一条由CaN信号分子所介导的CaN-NFAT3信号转导通路,其在心衰的发生过程中发挥了关键的调控作用,在慢性心力衰竭发生时,心肌组织中的CaN活性普遍增高,且发现外周血中CaN活性的升高与左心室肥厚程度成正比。而CaN是目前为止所认识到的唯一一种受Ca2+/钙调素调节的丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶,其作用时可使细胞浆中的T细胞活化核因子（Nuclear Factor of Activated T cells,NFATc）去磷酸化,进而引起NFATc向核内转位的一系列反应以及后续的转录活动,研究已经证实其主要生理底物为活化T细胞核因子3（nuclear factor of activated T cells3,NFAT3）、三磷酸肌醇（inositol trisphosphate,IP3）受体等,其在机体的免疫、心血管和神经系统中发挥了重要的调控作用。西医对慢性心力衰竭的治疗往往是采用毒毛旋花子甙等强心苷类药物进行治疗,然该类药物治疗量与中毒量极其接近,且对各脏器的毒副作用较大,许多患者往往是死于本类药物的毒副作用。近年来通过心衰治疗的临床观察与实验研究发现,中医药治疗慢性心力衰竭具有其独特的优势,具有毒副作用小,对收缩不能性和舒张不能性的急慢性心力衰竭均有较好疗效的特点。因此,本课题以中医辨证论治理论为基础,以中医药独特优势为出发点,采用温补心阳为主的治法,研究中医经典方“四逆汤”及附子有效成分在阿霉素所致的慢性心力衰竭大鼠中对CaN所介导的CaN-NFAT3信号转导通路的调控作用,最终揭示四逆汤及附子有效成分治疗慢性心力衰竭大鼠的分子机制。研究目的：分析CaN-NFAT3信号转导通路在四逆汤及附子有效成分治疗慢性心力衰竭过程中的分子机制。研究方法：取清洁级SD大鼠100,随机抽取20只作为空白对照组外,其余80只采用连续腹腔注射盐酸阿霉素的（每次0.0025g.kg-1,每周1次,连续6周）方法复制大鼠慢性心力衰竭模型,待造模成功后将动物分为两部分进行实验,第一部分进行四逆汤治疗实验,第二部分进行附子有效成分——附子苷治疗实验。第一部分实验：将造膜成功的大鼠随机分为模型对照组、四逆汤治疗组、地高辛治疗组、空白对照组。四逆汤治疗组给予7倍于人体有效用量的四逆汤煎剂,即每日2.8g/kg（人体体重以60kg为标准,四逆汤：附子10g,干姜9g,甘草6g）,模型对照组给予相同体积1ml/100g的生理盐水灌胃,阳性对照组给予地高辛0.1mg/kg,均于每天早上灌胃1次,连续治疗7周,后分别用CaN活性试剂盒、钙含量试剂盒、NFATc蛋白相对表达试剂盒、IL-2和IL-4试剂盒等,分别检测CaN的活性、心肌钙含量、去磷酸化NFATc蛋白的相对表达,IL-2和IL-4的含量等指标。第二部分实验：将造模成功的大鼠随机分为模型对照组（N=10）、附子苷高剂量组（N=10）、附子苷中剂量组（N=10）、附子苷低剂量组（N=10）,均采用灌胃给药,附子苷高剂量治疗组给予14倍于人体用量（以生附子人体煎服用量10g/天,体重为60kg为标准）,即每日给予0.7mg/kg,中剂量治疗组每日给予0.35mg/kg,低剂量治疗组每日给予0.18mg/kg,在给药之前将中剂量组与低剂量组分别稀释2倍与4倍,使高、中、低剂量组同体积,模型对照组给予同体积生理盐水灌胃,附子苷治疗组与模型对照组均于早上灌胃1次,连续治疗8天。结果：慢性心衰大鼠经过四逆汤及附子苷治疗后,心肌细胞的变性坏死明显改善,大鼠血流动力学指标好转,四逆汤治疗组CaN活性均低于模型组（P<0.01）、钙含量降低（P<0.01）、大鼠心肌组织中NFATc/β-actin光密度比值较模型对照组降低（P<0.01）等。结论：CaN-NFAT3信号转导通路的抑制为四逆汤及附子苷治疗慢性心力衰竭的关键分子机制。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文縮写词表
• 引言
• 实验研究
• 1 实验材料
• 1.1 实验药物
• 1.1.1 受试药物
• 1.1.1.1 四逆汤的制备
• 1.1.1.2 附子有效成分——附子苷的提取
• 1.1.2 阳性药物
• 1.1.3 造模药物
• 1.2 实验动物
• 1.3 实验场地
• 1.4 实验仪器
• 1.5 实验试剂
• 第一部分 四逆汤治疗慢性心衰大鼠实验研究
• 2 实验方法
• 2.1 大鼠慢性心力衰竭模型的复制
• 2.2 四逆汤治疗慢性心力衰竭大鼠血流动力学指标的观察
• 2.3 四逆汤治疗慢性心力衰竭大鼠心肌组织CaN测定实验
• 2+测定实验'>2.4 四逆汤治疗慢性心力衰竭大鼠心肌组织Ca²⁺测定实验
• 2.5 四逆汤治疗慢性心衰大鼠心肌组织NFATc测定实验
• 2.6 四逆汤治疗慢性心衰大鼠心肌组织IL-2、IL-4含量测定实验
• 2.7 四逆汤治疗慢性心衰大鼠心肌组织NO含量测定实验
• 2.8 四逆汤治疗慢性心衰大鼠心肌组织NOS含量测定实验
• +-K⁺-ATP酶活性测定实验'>2.9 四逆汤治疗慢性心衰大鼠红细胞膜Na⁺-K⁺-ATP酶活性测定实验
• 2.10 四逆汤治疗慢性心衰大鼠血清AST含量测定实验
• 2.11 四逆汤治疗慢性心衰大鼠血清LDH含量测定实验
• 2.12 四逆汤治疗慢性心衰大鼠血清CK含量测定实验
• 2.13 四逆汤治疗慢性心衰大鼠心肌组织病理学观察实验
• 3 实验结果
• 3.1 大鼠死亡率与一般情况观察
• 3.2 四逆汤治疗慢性心衰大鼠血流动力学指标观察
• 3.3 四逆汤治疗慢性心衰大鼠心肌组织各项指标检测
• 3.3.1 四逆汤治疗慢性心衰大鼠心肌组织CaN指标观察
• 2+指标观察'>3.3.2 四逆汤治疗慢性心衰大鼠心肌组织Ca²⁺指标观察
• 3.3.3 四逆汤治疗慢性心衰大鼠心肌组织NFATc指标观察
• 3.3.4 四逆汤治疗慢性心衰大鼠心肌组织IL-2指标观察
• 3.3.5 四逆汤治疗慢性心衰大鼠心肌组织IL-4指标观察
• 3.3.6 四逆汤治疗慢性心衰大鼠心肌组织NO指标观察
• 3.3.7 四逆汤治疗慢性心衰大鼠心肌组织NOS指标观察
• +-K-ATP酶活性测定观察'>3.3.8 四逆汤治疗慢性心衰大鼠红细胞膜Na⁺-K-ATP酶活性测定观察
• 3.3.9 四逆汤治疗慢性心衰大鼠血清AST、LDH、CK指标观察
• 3.4 四逆汤治疗慢性心衰大鼠心肌组织病理学观察
• 第二部分 附子苷治疗慢性心衰大鼠的实验研究
• 4 实验方法
• 4.1 附子苷治疗慢性心力衰竭大鼠血流动力学指标的检测
• 4.2 CaN在附子苷对慢性心力衰竭调控过程中的靶向实验
• 5 实验结果
• 5.1 附子苷治疗慢性心衰大鼠血流动力学指标与CaN指标检测
• 5.1.1 附子苷治疗慢性心衰大鼠血流动力学指标观察
• 5.1.2 附子苷治疗慢性心衰大鼠CaN指标的观察
• 6 讨论
• 6.1 心力衰竭的国内外研究
• 6.1.1 国外研究
• 6.1.2 国内研究
• 6.2 洋地黄治疗心力衰竭的现状分析
• 6.3 四逆汤研究现状
• 6.3.1 四逆汤处方来源
• 6.3.2 四逆方解
• 6.3.3 四逆汤现代药理研究
• 6.3.4 四逆汤“君药”——附子有效成分治疗心衰的现代研究
• 6.4 四逆汤治疗慢性心力衰竭的机制分析
• 6.4.1 CaN在四逆汤治疗慢性心衰过程中的靶向作用
• 6.4.2 去磷酸化NFATc蛋白的相对表达为四逆汤治疗慢性心衰提供分子基础
• 6.4.3 四逆汤治疗慢性心衰与其调控CaN-NFAT3信号转导通路的机制分析
• 6.4.4 运用四逆汤治疗后CaN-NFAT3信号转导通路各信号分子调控示意图
• 6.5 阿霉素复制大鼠慢性心力衰竭模型的功能评价
• 6.6 四逆汤治疗慢性心力衰竭大鼠各项检测指标的分析
• 6.6.1 对慢性心力衰竭大鼠血流动力学的影响
• 6.6.1.1 对左室最大压力上升速率的影响
• 6.6.1.2 对左室舒张末压的影响
• 6.6.1.3 对左室收缩压的影响
• 6.6.1.4 对动脉收缩压与动脉舒张压的影晌
• 6.6.1.5 对心率的影响
• 6.6.2 对慢性心衰大鼠心肌组织CaN的影晌
• 6.6.3 对慢性心衰大鼠心肌组织NFAT3的影响
• 2+的影响'>6.6.4 对慢性心衰大鼠心肌组织Ca²⁺的影响
• 6.6.5 对慢性心衰大鼠心肌组织IL-2、IL-4的影晌
• 6.6.6 对慢性心衰大鼠心肌组织NO的影响
• 6.6.7 对慢性心衰大鼠心肌组织NOS的影响
• 6.6.8 对慢性心衰丈鼠红细胞Na+-K--ATP的影胸
• 6.6.9 对慢性心衰大鼠血清AST、LDH、CK的影响
• 6.6.10 对实验大鼠心肌病理学的影响
• 总结
• 问题与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附件1：综述
• 1 CaN的概述
• 1.1 CaN的分布及结构组成
• 1.2 CaN的生物学作用
• 1.3 CaN在心肌肥大中的作用
• 2 NFAT的概述
• 2.1 NFAT的家族
• 2.2 NFAT的生物学作用
• 3 CaN-NFAT3 信号转导通路在心力衰竭发生过程中的作用
• 4 展望
• 参考文献
• 附件2：在读期间参与课题
• 附件3：在读期间公开发表的学术论文及著作