水稻胚乳特异强表达基因的筛选及其启动子功能的初步分析

论文摘要

基于水稻功能基因组数据库的相关数据,应用生物信息学方法从水稻数据库中搜索出50个种子特异表达基因,作为可能是胚乳特异性表达的候选基因。应用半定量RT-PCR技术分析各候选基因的时空表达模式,初步筛选出12个水稻胚乳特异表达基因,对其中一个暂命名为Latex-1的乳胶相关基因（Latex-related Gene）作进一步的研究分析。RT-PCR分析表明,Latex-1基因在水稻种子胚乳中特异性强表达,而在根、茎、叶、颖花、胚中均不表达；实时荧光定量PCR分析表明,Latex-1为胚乳特异性强表达基因,并且其表达水平与水稻胚乳灌浆过程密切相关。应用启动子分析软件plantCARE、 PLACE和plantpromoterdb2.0等对Latex-1基因上游约2.1kb的启动子调控区序列进行分析,发现在该启动子区相应位点处存在五大重要的胚乳特异性调控元件：GCN4motif、AACA motif、Prolamin-box、 ACGT motif和Skn-I-like motif,表明该启动子序列特征符合胚乳特异性启动子的调控元件分布特征。对Latex-1基因上游启动子区进行5’端缺失,同时扩增谷蛋白C基因（GluC）启动子片段作为相应的对照,分别构建启动子和报告基因GUS的融合表达载体。通过农杆菌介导侵染法将上述结构导入水稻,转基因水稻植株的分子检测和报告基因GUS的组织化学染色分析表明,GUS基因在转基因水稻植株的根、茎、叶和颖花中检测不到表达,而在种子胚乳中检测到明显地表达,可初步证明了Latex-1启动子是比较理想的胚乳特异性强表达启动子。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第1章 文献综述
• 1.1 生物信息学概论
• 1.1.1 生物信息学
• 1.1.2 生物信息学公共数据库
• 1.1.3 水稻功能基因研究相关的数据库
• 1.2 真核启动子的研究
• 1.3 胚乳特异性启动子的研究进展
• 1.3.1 谷蛋白基因启动子
• 1.3.2 醇溶蛋白基因启动子
• 1.3.3 球蛋白基因启动子
• 1.3.4 其他种子特异性基因的启动子
• 1.4 胚乳特异性启动子核心调控元件的功能研究
• 1.5 本课题的研究内容和目标
• 第2章 水稻胚乳特异表达基因的生物信息学筛选及表达模式分析
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 生物信息学数据库的应用和查找水稻种子特异的功能基因
• 2.2.2 水稻RNA的提取及反转录合成cDNA
• 2.2.3 半定量RT-PCR分析
• 2.2.4 实时荧光定量realtime-PCR分析
• 2.2.5 水稻胚乳灌浆速率的测定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 生物信息学方法获得候选基因
• 2.3.2 候选基因的半定量RT-PCR分析
• 2.3.3 Latex-1基因的real time-PCR分析
• 2.3.4 水稻胚乳的灌浆速率与Latex-1基因定时定量表达的内在关联
• 2.4 小结
• 第3章 Latex-1基因生物信息学分析及其启动子功能初步验证
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 供试水稻品种
• 3.1.2 菌株和质粒
• 3.1.3 主要试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 生物信息学分析
• 3.2.1.1 Latex-1基因的功能和蛋白结构域分析
• 3.2.1.2 Latex-1基因的启动子序列分析
• 3.2.2 Latex-1基因的启动子不同片段长度的克隆
• 3.2.3 构建启动子与GUS基因融合表达载体
• 3.2.4 基因组DNA的提取
• 3.2.5 转基因植株的分子检测
• 3.2.5.1 转基因植株的潮霉素抗性检测
• 3.2.5.2 转基因植株的PCR检测
• 3.2.5.3 转基因植株的GUS活性检测
• 3.3 结果和分析
• 3.3.1 Latex-1基因的功能和蛋白质结构域特征
• 3.3.2 Latex-1基因的启动子序列特征
• 3.3.3 Latex-1基因的5’端缺失启动子的克隆
• 3.3.4 分段缺失的Latex-1启动子-GUS双元表达载体的构建
• 3.3.5 转基因植株叶片潮霉素抗性筛选
• 3.3.6 转基因植株的PCR扩增结果
• 3.3.7 转基因植株的GUS活性检测结果
• 3.4 小结
• 第4章 讨论
• 4.1 胚乳特异性强表达基因的筛选
• 4.2 胚乳特异性基因Latex-1的研究
• 4.3 胚乳特异性启动子的调控基序研究
• 后续的工作
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 附录4
• 致谢