论文摘要
海藻糖（trehalose）是由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基缩合而成,无色无嗅,无毒,化学性质十分稳定。在细菌、酵母、真菌、藻类和昆虫中广泛存在,具有非常奇特的生理功能。作为酶、蛋白质及生物分子的有效稳定剂、添加剂,海藻糖以其广泛的用途和良好的应用市场前景而倍受瞩目。在几种生产方法中,酶法生产海藻糖因其成本低的明显优势将成为海藻糖生产的主要方式。本论文的主要目的在于以产海藻糖合成酶的自筛菌为研究对象,通过诱变育种和发酵、酶转化及海藻糖纯化的系统研究,打通一条具有工业化潜力的酶转化法制备海藻糖的工艺过程。论文的工作分为五个部分。第一部分为诱变育种。以自筛的Q186为出发菌株,经紫外诱变、吖啶、氯化锰、羟胺、DES化学诱变和DES-紫外线复合诱变处理,共得到了二株酶活高于出发菌株20%以上的菌：QS412和QF611。紫外线诱变得到的QS412酶活比出发菌株高65%以上；DES诱变酶活仅提高了13%左右；DES-紫外复合诱变酶活提高20%,三者中只有QS412传代稳定性良好。通过验证,证实诱变没有引起Q186和QS412中参与海藻糖合成的酶系特征和存在位置的改变,该酶主要位于细胞内,且只能以淀粉为其作用底物,初步判断为麦芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSase）与麦芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase）的双酶系。选定了胞内酶活性和传代稳定性良好的QS412为发酵用菌。第二部分为QS412的发酵条件优化及发酵动力学分析。使用QS412优化了其发酵培养基和培养条件,优化的培养基为：葡萄糖20g/L,酵母膏20g/L,蛋白胨10g/L, K2HPO4·3H2O1g/L, MgSO4·7H2O0.5g/L。用此配方进行摇瓶发酵,平均菌体湿重为17.3g/L,菌体海藻糖合成相关酶活性最高达到12.32Upc。在此基础上,用黄豆饼粉代替蛋白胨（玉米浆5%、黄豆粉0.2%、pH为7.5）,进行摇瓶发酵,平均菌体湿重达19.5g/L,比原基础配方（17.3g/L）高近13%;菌体海藻糖合成相关酶活性最高达到12.22Upc,基本与原配方（12.32Upc）持平。优化培养条件为30℃进行发酵,装液量为50mL,发酵时间为72h（34Upc左右）。对QS412在20L发酵罐上进行了发酵。采用pH值为8的玉米浆-黄豆粉培养基（葡萄糖20g/L,,玉米浆50g/L,黄豆粉2g/L,K2HPO4·3H2O1g/L, MgSO4·7H2O0.5g/L）,发酵温度为30℃,接种量为5%。20L发酵罐发酵较摇瓶培养发酵周期从72h缩短到48h,菌体最大湿重达到了61.2g/L,比摇瓶培养提高1倍以上；得到的菌体酶活基本相当。实验中发现QS412生长出现生长波动现象。通过对批次发酵的动力学分析,判断该菌产海藻糖合成酶的类型属于生长部分关联型。第三部分为QS412产酶特性研究。在选择了适当的海藻糖合成酶释放条件后,确定该双酶体系合成海藻糖的最佳酶活性在pH8、100mM磷酸钾缓冲溶液、40℃时达到。但40℃酶失活曲线显示该温度下酶会在短时间内失活：静止保温下5h酶活损失近50%,100rpm搅拌下3.5h酶活降低50%。实验确定了游离酶合成海藻糖的优化条件为以DE值为10%的10%淀粉为底物,在pH8、100mM缓冲液、30℃下反应25hr,酶反应后体系中海藻糖浓度为31.73mg/mL,淀粉转化率为63.5%。研究表明,该酶反应过程无底物和产物抑制作用,在海藻糖添加量达到0.3mol/L时,观察到了酶活的异常提高。反应体系中添加金属离子时观察到Mg2+对酶活有提高作用,Zn2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Hg2+五种二价离子对体系酶活有明显抑制作用。Hg2+的抑制作用最为明显。作者认为该酶系活性中心可能容易与二价阳离子相互作用。通过实验表明Zn2+在40mM浓度以上能完全抑制体系中MTHase的活性,并且这种抑制作用可以通过添加EDTA消除,提出利用添加Zn2+和EDTA的方法制备MTHase底物及在两种酶存在下单独测定MTSase活性的设想。第四部分为QS412透性化细胞合成海藻糖研究。研究表明,甲苯可有效改进玫瑰微球菌QS412细胞膜的通透性。得到通透性良好而又不破坏细胞膜和酶的甲苯处理条件：30℃,5%甲苯溶液,处理40min。用透性化细胞转化液化淀粉为海藻糖的优化生产条件是：30℃,pH为8的0.1M磷酸盐缓冲溶液中,反应时间不超过12h。得到的透性化细胞海藻糖合成能力为0.369g海藻糖/g透性化细胞,淀粉转化率为73.8%。为提高总海藻糖得率,尝试采用反应时间为4h和12h的多批次重复使用透性化细胞合成海藻糖,单批4h共16批的反应中,总海藻糖得率可达到5.05g海藻糖/g透性化细胞,与单批相比透性化细胞海藻糖单位时间产量提高了155%,菌体总生产能力提高到单批细胞的13.7倍。透性化细胞的研究为海藻糖生产提供了一个有工业化前景的廉价方法。得到了合成海藻糖过程的本征动力学表达式（rp=27.78Cs/（29.96+Cs））和表观动力学表达式（Rp=24.63Cs/（133.78+Cs））,实验表明此过程外扩散影响可忽略,内扩散过程显著影响反应速率。第五部分初步探讨了海藻糖纯化工艺：透性化细胞反应液分离细胞后,首先经液化和糖化淀粉酶降解麦芽寡糖并用截留分子量6000的超滤膜截留大分子物质（主要是蛋白质）；然后在活性炭柱上吸附、水洗并用10%乙醇洗脱,收集洗脱峰后将溶液进行浓缩干燥。过程海藻糖总收率为95%。研究了海藻糖在活性炭柱上的动态吸附特性,并计算了上样量。这些数据对进一步研究海藻糖在活性炭柱上的纯化有一定意义。得到纯度为97.4%的海藻糖晶体,用核磁共振法对晶体进行检测,证实了该结晶确为海藻糖。本论文研究内容涉及从新产酶菌种的选育、菌种发酵培养基和培养条件的优化以及菌内产酶特性的研究,到采用透性化细胞合成海藻糖及海藻糖的纯化。通过以上研究结果,可实现以淀粉为原料,以生物发酵法培养产海藻糖合成酶的菌体,用多批次胞内酶转化法生产海藻糖,经纯化得到结晶海藻糖的工艺过程。为海藻糖生产提供了一个新途径,并为该生产过程提供了基础数据和方法。