论文摘要
前言小胶质细胞（MG）在阿尔茨海默病（AD）等神经变性病炎性发病机制中的作用越来越受到关注。MG的活化具有双重作用。一方面,它可以产生多种前炎性因子,具有神经毒性;另一方面,它又可以产生一些神经营养因子,而更重要的是,其对β淀粉样蛋白（Aβ）具有吞噬能力。目前,多数研究者立足于通过抑制MG的活化来减轻炎症介导的神经损伤。在AD中,非选择性地阻断MG的功能虽然可以减弱局部的炎性反应,但同时也抑制了MG对Aβ的吞噬作用,可能使更多的Aβ聚集沉积而最终导致病情恶化。因此,如何有效地调控MG的功能,既提高其特异性吞噬Aβ的能力,又能尽量抑制其产生炎性细胞因子和NO等,是应用MG作为AD的一种治疗手段的根本方向。近年来,有关骨髓干细胞（BMSC）来源MG的研究成为热点。已经证实,BMSC能够透过血脑屏障进入中枢神经系统,并分化为功能性MG。这种骨髓来源的MG（BMDM）更易被吸引到神经病变区域。在AD鼠模型中老年斑周围的MG中90%以上是骨髓源性的,这种BMDM通过吞噬Aβ而起到延缓疾病进展的作用。而且,BMDM与固有MG相比是更有效的抗原递呈细胞和更有效的吞噬细胞。因此骨髓细胞移植可能成为AD的一种新的治疗策略。中药十全大补汤由十味中草药组成:黄芪、肉桂、当归、白芍、川芎、熟地、人参、白术、茯苓、甘草,其组方内含有多种免疫调节成分,可起到抗炎、抗氧化、抗过敏等作用。已经证明:其不仅可以影响获得性免疫系统,还可影响固有免疫系统。这为我们立题于探讨十全大补汤对神经系统病变中以MG为代表的固有免疫系统可能起到一定的抗炎、抗氧化作用奠定了基础。我们的前期研究发现,给予AD转基因小鼠口服十全大补汤能够减少老年斑沉积,我们推测这可能是通过促进MG对Aβ的吞噬作用实现的。本研究应用十全大补汤萃取物,首先进行体外刺激MG,考察其对MG的增殖、活化、对纤维化Aβ1-42的吞噬以及向神经毒性/神经营养性转归的影响。在动物实验部分,我们首先考察BMSC究竟是否能够进入正常脑,给予十全大补汤能否促进其向正常脑组织的移行。另外,我们通过海马内注射Aβ的方法模拟AD病变环境,考察给予十全大补汤能否通过促进BMSC向病变部位的归巢,进而通过增加其对Aβ的吞噬而减轻病变,目的在于为AD的治疗寻找新的契机。方法原代培养MG（或使用Ra2细胞系）,以十全大补汤刺激后,用WST-1检测细胞增殖力,流式细胞术检测活化的表面标志物CD11b,免疫荧光染色法检测MG对纤维化Aβ1-42的吞噬,Griess法检测细胞培养上清中NO的含量,Bio-PlexTMCytokine Assay检测细胞培养上清中多种细胞因子的含量。在体实验部分,通过给予小鼠移植表达EGFP的骨髓细胞建立了嵌合体鼠模型,以便追踪外源性细胞入脑的情况。在实验一部分,用流式细胞术鉴定小鼠血中GFP阳性细胞和CD11b阳性细胞比例数;用免疫组化方法检测鼠脑实质内GFP阳性细胞和Iba1阳性细胞。在实验二部分,用免疫染色方法检测鼠脑海马Aβ注射病灶及病灶周围聚集的GFP阳性细胞、非病灶临近部位的GFP阳性细胞、并鉴定GFP阳性细胞的表型。实验数据以均值±标准差表示。数据分析采用SPSS13.0 for windows进行。应用单因素方差分析、重复测量方差分析或t检验来判断差异的统计学意义。结果1、十全大补汤对MG形态、增殖力及表面标志物CD11b表达的影响相差显微镜下观察到用十全大补汤刺激后的原代MG由静息状态变成了细胞体大、突起短的阿米巴样形态。十全大补汤增加MG的活力和增殖力,呈轻度的剂量依赖性。流式细胞仪分析显示:在对Ra2细胞处理48 hrs后,十全大补汤组CD11b阳性的活化MG所占的比例及其平均荧光强度两指标较阴性对照组相比均明显增高。2、十全大补汤对MG吞噬纤维化Aβ1-42的影响在浓度依赖性实验中,经过24 hrs的处理,200μg/ml以上浓度的十全大补汤能够显著促进MG对纤维化Aβ1-42的吞噬,但不显示浓度依赖性。在时间依赖性实验中,采用200μg/ml的浓度,经过24 hrs的处理可以得到最大的吞噬细胞比例数60.4±4.4%,不显示时间依赖性。3、十全大补汤对MG产生NO及细胞因子的影响单独给予十全大补汤轻度增加NO的产量,但与阴性对照组相比无统计学意义。在存在纤维化Aβ1-42的条件下,尽管十全大补汤未显示出减少NO产量的作用,但其并未显示出促进作用。在各个时间点,单独给予十全大补汤对TNF-α的产量与阴性对照组相比没有差异。在6 hrs时间点可以检测到十全大补汤可以抑制纤维化Aβ1-42产生TNF-α。IL-1β、IL-6和IL-10的含量只在24 hrs处理后可明显检测到。单独给予十全大补汤对IL-1β、IL-6和IL-10的产量与阴性对照组相比明显增加;而且IL-10的含量还明显高于纤维化Aβ1-42处理组。十全大补汤不显示促进或抑制纤维化Aβ1-42引起的IL-1β、IL-6和IL-10的产生。4、流式细胞术鉴定实验一组小鼠血中GFP阳性细胞和CD11b阳性细胞比例数嵌合鼠79%以上的血白细胞由移植来源的骨髓细胞产生,对照组和实验组间无统计学差异。实验组的CD11b阳性细胞占总血白细胞的比例数明显高于对照组。5、免疫组化方法检测实验一组脑实质内GFP阳性细胞和Iba1阳性细胞在对照组和实验组小鼠小脑内均偶可见GFP阳性细胞,十全大补汤未显示明显作用。与对照组相比,十全大补汤明显增加正常小鼠脑海马区固有MG的数量。6、免疫荧光染色检测实验二组脑海马注射病灶及周围的GFP阳性细胞在实验组和对照组均发现注射病灶周围和病灶内部聚集了数量很多的GFP阳性细胞。而且,在PBS注射点及注射路径周围同样可见GFP阳性细胞的聚集。7、免疫组化染色检测实验二组鼠脑非病灶临近部位GFP细胞由于对病灶周围GFP阳性细胞的计数难于得到很精确的统计结果,我们对腹侧约3/5部分脑区内的GFP阳性细胞数进行了比较,实验组与对照组相比GFP阳性细胞数明显增多。8、免疫荧光染色鉴定脑内GFP细胞的表型实验二组小鼠无论是对照组还是实验组,脑内注射病灶周围区和远离病灶位置的GFP阳性细胞绝大部分呈现MG表型,未发现呈现神经元和星型胶质细胞表型的GFP细胞。结论1、十全大补汤引起MG呈现明显的活化形态。2、十全大补汤促进MG的增殖,并增加MG活化的表面标志物CD11b的表达。3、十全大补汤能够促进MG对纤维化Aβ1-42的吞噬。4、十全大补汤在MG向神经毒性序申经营养性的转归中起到平衡作用。5、对于无脑部损伤的小鼠,口服十全大补汤能够促进血中CD11b阳性的单核巨噬细胞系统的增殖,同时能够增加脑中固有MG的数量。但是,仅在小脑实质内发现为数不多的BMDC。6、在AD小鼠模型中,BMDC聚集到病灶内部及周围,分化为MG,可能对吞噬Aβ起到有益作用。十全大补汤能够增加非病变临近脑区的BMDC的数量,且仍呈现MG表型。未发现迁移入脑的BMDC分化为神经元或星型胶质细胞。
论文目录
相关论文文献
标签：小胶质细胞论文; 阿尔茨海默病论文; 十全大补汤论文; 骨髓源性小胶质细胞论文; 淀粉样蛋白论文;