基于thyA基因的染色体—质粒平衡致死系统的构建

论文摘要

目前,外源基因表达载体多以抗生素抗性基因作为选择标记,对于基因治疗和基因免疫用表达载体,这些抗性标记基因的存在有可能引起一系列生物安全性问题。因此,需用更为安全的非抗生素抗性标记表达载体,其中染色体-质粒平衡致死系统具有广泛的应用前景。为了构建用于动物基因治疗和基因免疫的非抗性标记表达载体,我们将DH5α大肠杆菌在含有胸腺嘧啶核苷和3-甲氧2-氨嘧啶的CBT培养基上进行选择培养,筛选得ThyA-突变株21株。这些突变株在不含胸腺嘧啶核苷的CB琼脂平板上不生长,只有在添加胸腺嘧啶核苷的培养基或转化thyA表达载体后才能在正常培养基生长。为了研究thyA基因突变的分子机理,用高保真PCR法克隆4个突变株的thyA基因,序列分析结果显示,4、7、13号菌株在70位碱基起有6个碱基缺失,导致25位甘氨酸和26位苏氨酸的缺失;6号突变株在92位碱基由G突变为A,导致31位甘氨酸被天冬氨酸替换。用PCR克隆野生大肠杆菌的ThyA基因,将其克隆入原核表达载体,用重组大肠杆菌表达的重组蛋白免疫小鼠,用获得的抗血清进行免疫转印试验,结果发现突变株的ThyA基因仍能表达。根据鼠伤寒沙门氏菌菌株thyA基因序列设计一对引物,用PCR扩增包括启动子的thyA基因,将序列正确的基因取代表达人溶菌酶基因的真核载体pcDNAKLYZ中的卡那抗性基因,获得非抗性选择标记表达载体pDTALYZ。将其转化ThyA-DH5α大肠杆菌,转化菌涂布不含胸腺嘧啶核苷的CB平板,筛选得非抗性标记重组大肠杆菌。在CBt液体培养基传20代未发现质粒丢失,酶切鉴定正确。将pcDNAKLYZ重组菌和pDTALYZ重组菌在相同条件下,以普通的LB为培养液进行高密度发酵培养,发现两种重组菌的生长曲线无明显差异;发酵结束后,定量取样提取质粒DNA和进行定量测定,结果显示两种重组菌的质粒产量无差异;定量取样分别在普通和选择培养基上培养,发现两种重组菌的质粒丢失率分别为38.1%和15.7%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述 染色体-质粒平衡致死系统的构建与应用
• 1. 基因治疗与基因免疫
• 1.1 基因治疗
• 1.2 基因免疫
• 2. 重组载体的设计要求
• 2.1 与宿主基因组整合及诱发突变的危险性
• 2.2 诱发自身免疫或免疫耐受的危险性
• 2.3 水平传播及对环境的危害性
• 2.4 在动物产品中的残留及其对人体的危害性
• 3. 染色体—质粒平衡致死系统
• 3.1 基本原理
• 3.2 常用的营养缺陷标志基因
• 3.2.1 asd 基因
• 3.2.2 thyA 基因
• 3.2.3 glnA 基因
• 3.3 染色体一质粒平衡致死系统的构建
• 3.3.1 缺陷型菌株的构建
• 3.3.2 互补质粒的构建
• 3.4 染色体一质粒平衡致死系统的应用
• 3.4.1 在减毒疫苗中的应用
• 3.4.2 在基因疫苗中的应用
• 4. 问题与展望
• 参考文献
• -大肠杆菌突变株的筛选与鉴定'>研究内容一 THYA^-大肠杆菌突变株的筛选与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株与质粒
• 1.1.2 试验动物
• 1.1.3 主要试剂和仪器
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 引物的设计
• 1.2 方法
• -大肠杆菌的选育'>1.2.1 ThyA^-大肠杆菌的选育
• 1.2.2 突变株生长特性试验
• 1.2.3 突变株稳定性试验
• 1.2.4 ThyA 基因序列分析
• 1.2.5 大肠杆菌ThyA 基因表达载体的构建
• 1.2.6 重组ThyA 的表达
• 1.2.7 ThyA 抗体的制备与鉴定
• 1.2.8 大肠杆菌突变株ThyA 基因表达分析
• 2 结果
• -大肠杆菌的选育'>2.1 ThyA^-大肠杆菌的选育
• 2.2 突变株生长特性
• 2.3 突变株的稳定性
• 2.4 突变基因的序列分析
• 2.5 重组THYA 的表达
• 2.6 THYA 抗体的制备与鉴定
• 2.7 突变株THYA 基因表达分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 研究内容二 以THYA 基因为非抗性选择标记真核表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 质粒与菌株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 试验动物
• 1.4 PCR 引物的设计
• 1.5 DNA 模板的制备
• 1.6 THYA 基因的PCR 扩增
• 1.7 PCR 产物回收
• 1.8 PDTALYZ 的构建
• 1.9 重组质粒的转化
• 1.10 发酵过程中重组菌的遗传稳定性
• 2 结果
• 2.1 PCR 扩增产物电泳结果
• 2.2 PDTALYZ 的酶切鉴定
• 2.3 PDTALYZ 与 THYA-大肠杆菌转化
• 2.4 转化效率的比较
• 2.5 发酵过程中的遗传稳定性
• 3 讨论
• 参考文献
• 结论
• 致谢