农杆菌介导的百合遗传转化研究

论文摘要

百合是具有极高观赏价值,广泛用于切花、盆栽与庭院绿化的一类球根花卉。其新品种的选育和商品种球的供应是我国花卉产业上的一项迫切任务。百合的遗传转化工作起步较晚,但在近十年时间中取得了相当大的进展,然而真正利用转基因技术培育的百合品种目前尚未见报道。本课题涉及百合稳定高效再生体系的建立以及农杆菌介导的遗传转化两大方面。目前取得的主要成果如下：1)摸索出了百合鳞片薄层切片的间接再生途径,即先从鳞片薄层切片上诱导出愈伤组织,再由愈伤组织分化出苗,最后使再生苗产生小鳞茎。实验发现,横切薄层切片68.75%的愈伤组织诱导率明显高于纵切薄层切片25.96%的愈伤组织诱导率。小鳞片各部位的愈伤组织诱导能力大小依次为：下部>中部>上部,其中下部的诱导率高达93.33%。而不同部位的愈伤组织进行再分化的能力也有差异,其中下部的愈伤组织再分化能力明显高于上、中部。在光照/黑暗=16h/8h的条件下,诱导出来的愈伤组织褐化严重,且较早地分化出芽点：而在黑暗条件下诱导出的愈伤组织没有褐化,且培养早期不分化芽点。2)在‘耀眼黄’百合愈伤组织分化试验中,不添加任何激素的MS培养基上愈伤分化出芽率最高,为90%。随着BA浓度的提高,愈伤组织的褐化越来越严重。为了在转化体的筛选过程中,快速比较不同转化条件的优劣,应选择不添加任何激素的MS培养基作为筛选分化的培养基。3)在组培苗鳞茎膨大的研究中发现,随着浓度的升高,ABA对产生小鳞茎的促进作用呈现出先升后降的趋势。当ABA浓度为0.05 mg/L时效果最好,分化出小鳞茎的苗数占95%。而当ABA浓度过高时,小鳞茎的再生反而受到抑制。随着浓度的升高,ABA对小鳞茎膨大的促进作用呈现出先升后降的趋势,当浓度为0.2 mg/L时效果最好,小鳞茎平均重约166 mg。4)百合鳞片的直接再生途径的研究结果表明,90 g/L的蔗糖浓度最适于鳞茎的诱导及生长；再生鳞茎的大小随着培养基中大量元素含量的升高而增加,1.5 MS培养基的效果最佳；在培养基中同时添加1 mg/L BA与0.2 mg/L NAA可以显著提高鳞片再生小鳞茎的数量：水杨酸对鳞片分化小鳞茎具有抑制作用;低浓度的多效唑对鳞片再生的影响不明显,高浓度时具有一定的抑制作用。综合以上结果,确定鳞片再生与小鳞茎生长的最佳培养基为1.5 MS+1 mg/L BA+0.2 mg/L NAA+90 g/L蔗糖。5)以‘耀眼黄’百合的愈伤组织为转化受体时,确定卡那霉素选择压为75 mg/L。所转化的目的基因包括TA29-Barnase基因、35S-CBF3基因、百合LsAG基因的干涉载体（35S-LsAGRi）.‘耀眼黄’百合的愈伤组织颗粒细小,松散易碎,在侵染和共培后很容易褐化死亡,即使有成苗,苗子生活力也很差。在转化35S-CBF3基因后得到8株抗性苗,其中6株PCR检测为阳性；转化TA29-Barnase基因后得到4株抗性苗,其中3株PCR检测为阳性。6)以麝香百合鳞片薄层切片为转化受体时,确定卡那霉素选择压亦为75 mg/L所转化的目的基因分别为TA29-Barnase（?）（?）35S-LsAGRi。转化后仅得到可能携带TA29-Barnase嵌合基因的9株抗性苗。经PCR检测,嵌合体的比例较大。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 前言
• 1 文献综述
• 1.1 百合的种质资源及育种方向
• 1.1.1 百合的种质资源
• 1.1.2 百合的育种方向
• 1.2 百合的组织培养技术
• 1.3 百合的分子育种
• 1.4 植物的AG同源基因
• 1.5 植物CBF基因家族
• 1.6 RNAi技术
• 1.7 利用基因工程创造植物雄性不育
• 1.7.1 通过核酸酶基因的特异空间表达创造雄性不育系
• 1.7.2 利用反义基因获得植物雄性不育
• 1.7.3 改变激素含量与比例获得雄性不育植株
• 1.7.4 利用外源细胞毒素基因的特异表达获得雄性不育植株
• 1.7.5 使胼胝质壁提前降解获得雄性不育植株
• 2 研究目的和意义
• 第二部分 百合高频再生体系的建立
• 1 材判与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验条件
• 1.3 主要药品及基本培养基
• 1.4 试验方法
• 1.4.1 百合鳞片薄层切片的间接再生途径
• 1.4.1.1 愈伤组织的诱导
• 1.4.1.2 愈伤组织的分化
• 1.4.1.3 再生苗的鳞茎膨大试验
• 1.4.2 百合鳞片的直接再生途径
• 1.4.2.1 不同蔗糖浓度对比
• 1.4.2.2 大量元素浓度对比
• 1.4.2.3 BA,NAA的不同组合的对比
• 1.4.2.4 不同水杨酸浓度的对比
• 1.4.2.5 不同多效唑浓度的对比
• 2 结果与分析
• 2.1 愈伤组织诱导及再分化途径各因素影响情况
• 2.1.1 愈伤组织的诱导
• 2.1.2 愈伤组织的再分化
• 2.1.3 再生苗鳞茎膨大情况
• 2.2 鳞片直接再生途径中各因素的影响
• 2.2.1 不同蔗糖浓度对鳞茎诱导及生长的影响
• 2.2.2 不同大量元素浓度对鳞茎诱导及生长的影响
• 2.2.3 不同激素（BA,NAA）及其配比对鳞茎诱导及生长的影响
• 2.2.4 不同浓度水杨酸对鳞茎诱导及生长的影响
• 2.2.5 不同浓度多效唑对鳞茎诱导及生长的影响
• 3 讨论
• 3.1 鳞片直接再生小鳞茎途径
• 3.2 薄层切片培养体系中各因素的影响
• 3.3 百合愈伤组织的分化
• 第三部分 农杆菌介导的百合遗传转化
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 农杆菌菌株与目的基因载体
• 1.3 主要药品和设备
• 1.4 试验培养基
• 1.5 试验方法
• 1.5.1 Kan对百合鳞片、愈伤组织的抗性筛选
• 1.5.2 以百合小鳞茎薄层切片为转化受体的遗传转化
• 1.5.3 以百合愈伤组织为转化受体的遗传转化
• 1.5.4 百合基因组DNA的提取
• 1.5.4.1 CTAB法提取百合基因组DNA
• 1.5.4.2 NaOH裂解法快速提取百合基因组DNA
• 1.5.5 遗传转化抗性苗的分子检测
• 2 结果与分析
• 2.1 卡那霉素对小鳞片切片、愈伤组织的抗性筛选
• 2.2 转基因植株的获得
• 3 讨论
• 3.1 选择抗生素的使用
• 3.2 农杆菌介导法中培养基成分对转化率的影响
• 3.3 农杆菌介导法中培养基pH值对转化率的影响
• 3.4 农杆菌介导法中受体材料对转化率的影响
• 3.5 转化体的筛选
• 参考文献
• 致谢